Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

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产品优势

通过酶循环反应精准识别NADP/NADPH，无需从样品混合物中纯化。

 

适用范围

用于总NADP和NADPH检测

 

产品介绍

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化衍生物（NADP⁺）是细胞内两种至关重要的辅酶。其中，NADH是NAD⁺的还原态，而NAD⁺则是NADH的氧化态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团后，即形成NADP⁺。该辅酶主要作为还原剂NADPH参与多种合成代谢过程，包括脂肪酸与核酸的生物合成。在叶绿体中，NADP⁺作为氧化剂参与光合作用初始反应，所产生的NADPH随后为光合作用卡尔文循环中的生物合成反应提供还原力。传统的NAD/NADH和NADP/NADPH检测通过监测340nm处的吸光度来实现，但由于该方法需在紫外区使用昂贵的石英微孔板，存在灵敏度低、干扰性强的缺点。

Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒（荧光法）红色荧光提供了一种便捷、高灵敏度的检测方案。检测系统中的特异性酶通过酶循环反应精准识别NADP/NADPH，无需对样本进行预先纯化。该酶循环反应可显著提高检测灵敏度。此外，由于检测在可见红光区（激发570nm/发射590nm）进行，能大幅降低生物样本的干扰，具有极低的背景值。实际检测表明，该试剂盒具有高灵敏度和低干扰的特性。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板
光吸收酶标仪
吸收:	576 ± 5 nm
推荐孔板:	透明底板

96孔板测定示例

概述

准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟--2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.制备NADP / NADPH反应混合物：

将10mL NADP / NADPH传感器缓冲液（组分B）加入NADP / NADPH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至10μM）：

3.1将10μLNADPH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液中以产生10M（10pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL10μMNADPH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADPH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM连续稀释液。

3.3如表1和2中所述，将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1.实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。

 

表2.每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

注意：将连续稀释的NADPH标准品从0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>100μM，终浓度）可能由于NADPH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

 

4.在上清液中运行NADP / NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（佳540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于NADP / NADPH比率测量，建议使用Cat#15264。

注意3：对于基于细胞的NADP / NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。