Amplite 荧光法黄嘌呤检测试剂盒

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产品优势

在100μL反应体系中可检测低至0.4μM的黄嘌呤浓度

适用范围

用于黄嘌呤检测

产品介绍

黄嘌呤作为嘌呤碱基广泛存在于人体组织和体液中。多种黄嘌呤衍生物（包括咖啡因、氨茶碱、IBMX、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱和茶碱等）具有刺激心脏活动的作用，高浓度时可引发心率加快、心肌收缩力增强及心律失常等反应。因此，检测生物样本中黄嘌呤水平的变化对疾病诊断和治疗监测具有重要意义。

Amplite®荧光法黄嘌呤检测试剂盒提供了一种快速、超灵敏的黄嘌呤检测方案，支持96孔或384孔微孔板检测模式。检测原理为：在黄嘌呤氧化酶作用下，黄嘌呤被氧化为尿酸并释放过氧化氢，随后通过Amplite® Red荧光探针特异性检测过氧化氢含量，最终经荧光酶标仪进行定量分析。该试剂盒在100μL反应体系中可检测低至0.4μM的黄嘌呤浓度。

适用仪器

样品实验方案

简要概述

1.准备黄嘌呤标准品或测试样品（50 µL）
2.添加黄嘌呤工作溶液（50 µL）
3.在室温下孵育30-60分钟
4.在Ex / Em = 540/590 nm时读取荧光强度

溶液配制

1.储存溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 Amplite Red底物储备液（250X）：
在Amplite Red底物（组分A）的小瓶中加入40 µL DMSO（组分F）。 注意：Amplite Red底物在硫醇（例如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇）的存在下不稳定。 反应中DTT或2-巯基乙醇的终浓度应不高于10 µM。 由于Amplite Red在pH> 8.5时不稳定，因此应在pH 7-8（建议pH 7.4）下进行测定。

1.2 HRP储备溶液（500X）：
将100 µL测定缓冲液（组分B）加到辣根过氧化物酶（组分C）小瓶中。

1.3 黄嘌呤氧化酶（XO）储备溶液（100X）：
向小瓶黄嘌呤氧化酶（组分E）中加入100 µL测定缓冲液（组分B）制成黄嘌呤氧化酶（XO）储备液（100X）。

2.标准溶液配制

黄嘌呤标准品
将5 µL黄嘌呤标准品（组分D）添加到995 µL测定缓冲液（组分B）中，得到100 µM黄嘌呤标准溶液。 取200 µL 100 µM黄嘌呤标准溶液进行1：3连续稀释，以得到连续稀释的黄嘌呤标准液（X1-X7）。

3.工作溶液配制

将20μL的Amplite Red底物储备液（250X），10μL的HRP储备液（500X）和50μL的黄嘌呤氧化酶储备液（100X）加到5 mL的测定缓冲液（组分B）中，制成总体积 5.08毫升。

注意：避免直接暴露在光线下并立即使用。

样品操作及实验分析

表1.黑色壁/实心底部96孔微孔板中黄嘌呤标准品和测试样品的布局。 X =黄嘌呤标准品（X1-X7，0.137至100 µM）； BL =空白对照； TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和表2提供的布局，准备黄嘌呤标准品（X），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂，而不是50 µL。

2.在黄嘌呤标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 µL黄嘌呤工作溶液，使总黄嘌呤测定体积为100 µL /孔。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 µL工作溶液，总体积为50 µL /孔。

3.在避光条件下，于室温下孵育反应30至60分钟。

4.使用酶标仪在激发= 530-570 nm（佳540 nm），发射= 590-600 nm（佳590 nm），截止= 570 nm的条件下监控荧光的增加。