Amplite 荧光法基质金属蛋白酶MMP-3活性检测试剂盒 绿色荧光

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适用范围

用于基质金属蛋白酶MMP-3活性检测

 

产品介绍

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性内肽酶家族，主要作用于细胞外基质。这些酶负责结缔组织的分解，在骨重塑、月经周期及组织损伤修复过程中发挥重要作用。尽管MMPs在特定病理过程中的确切作用机制尚难评估，但研究证实其在关节炎发展以及癌症侵袭转移过程中起关键作用。

MMPs通常具有多重底物特异性，大多数家族成员能够降解多种胶原蛋白，同时还可分解弹性蛋白、明胶和纤连蛋白。因此，筛选对单一MMP酶具有选择性的底物极具挑战性。本FRET底物经特殊设计，对MMP-3具有相对较高的选择性，可用于监测MMP-3活性。当使用纯化的MMP-3酶时，还可用于MMP-3抑制剂的筛选。

该FRET底物基于TF2/TQ2荧光共振能量转移对设计。当MMP-3发生水解反应时，MMP-3 Green™ FRET肽底物中的TF2/TQ2 FRET对发生分离，导致荧光信号增强。该荧光增强效应与MMP-3酶活性呈正相关。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	490nm
Em:	525nm
Cutoff:	515nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

添加适当的对照或测试样品（50μL）

预孵育10-15分钟

添加MMP Green 底物溶液（50μL）

孵育0分钟（用于动力学读数）或30分钟至1小时（终点读数）

在Ex / Em = 490/525 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.根据需要制备含有生物样品的MMP。

 

2.pro-MMPs：

2.1制备2mM APMA工作溶液（2X）：用1：500稀释1M APMA（组分B）和测定缓冲液（组分C），得到2mM APMA工作溶液（2X）。

注意：APMA属于有机汞。 小心轻放！ 根据当地法规处理。

2.2用APMA包埋MMPs：用等体积的2mM APMA工作溶液（2X，来自步骤2.1）孵育含有MMP的样品或纯化的MMPs。 有关孵育时间，请参阅说明书中的附录I. 在实验之前立即MMP。

注意1：将含酶样品保存在冰上。 避免剧烈涡旋酶。长时间储存活化酶会使酶失活。

注意2：对于酶活化，优选在较高蛋白质浓度下活化。后，您可以进一步稀释酶。

 

3.准备工作解决方案：

3.1制备MMP Green 底物工作溶液：用1：100稀释MMP Green 底物（组分A）和测定缓冲液（组分C），如说明书中表1所示。

3.2制备MMP稀释：如果使用纯化的MMP，则在测定缓冲液（组分C）中将MMP稀释至合适的浓度。

注意：Pro-MMP需要在使用前（参见步骤2.2）。 避免剧烈涡旋酶。

3.3制备抑制剂和化合物稀释：如果您正在筛选MMPs抑制剂，请根据需要稀释已知的MMPs抑制剂和测试化合物。

 

4.根据说明书中的表2和表3在96孔微孔板中建立酶促反应：

 

5.运行酶反应：

5.1如果您正在筛选MMPs抑制剂，则将培养板在酶反应（例如25°C或37°C）的所需温度下预孵育10-15分钟。

5.2将50μL（96孔）或20μL（384孔）MMP Green 底物溶液（来自步骤3.1）加入到测定板的样品和对照孔中。充分混合试剂。

5.3用Ex / Em = 490 / 525nm的荧光板读数器监测荧光强度。

动态读数：立即开始测量荧光强度，每5分钟连续记录数据30至60分钟。

终点读数：在室温下孵育反应30至60分钟，如果可能，避免光照。 充分混合试剂，然后测量荧光强度。