Amplite 硫醇快速定量试剂盒 比色法

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产品优势

1.快速稳定：操作步骤简捷，结果稳定可靠；

2.兼容传统比色皿、NanoDrop™分光光度计或配备紫外透射板的96孔板读数仪等多种检测平台。

 

适用范围

用于硫醇定量

 

产品介绍

蛋白质硫醇基团对蛋白质结构、蛋白质功能及生物系统氧化还原环境具有至关重要的作用。以血浆中含量最丰富的蛋白质——白蛋白为例，其分子中的游离硫醇被认为是体内重要的血浆抗氧化剂。白蛋白硫醇状态的改变与多种疾病密切相关，包括肾脏疾病和帕金森病等。虽然目前已有部分试剂或检测试剂盒可用于定量生物系统中的总硫醇含量，但如何快速准确地测定特定蛋白质中游离硫醇基团的含量仍是关键挑战。

Amplite®快速比色法硫醇定量检测试剂盒采用我们专用的Thiol Blue™硫醇探针（最大吸收峰位于~680 nm），为游离硫醇定量提供了精准解决方案。当Thiol Blue™与含游离硫醇基团的蛋白质样本反应后，通过单次离心柱纯化去除多余的Thiol Blue™探针，随后测定纯化产物的吸收光谱。根据680 nm与280 nm的吸光度比值即可计算出硫醇-蛋白质的摩尔比。本试剂盒兼容传统比色皿、NanoDrop™分光光度计或配备紫外透射板的96孔板读数仪等多种检测平台。

 

标准操作流程

重要注意事项：

试剂盒组分在适当保存条件下可稳定保存六个月。切勿冷冻离心柱（组分C）。所有组分需恢复至室温后使用。每次检测需50-100 µg蛋白质样本。

 

实验步骤

样本溶液制备

用测定缓冲液（组分B）将50-100 µg蛋白质样本定容至100 µL

注：样本缓冲液pH值应为6.0，且不得含有DTT或其他含游离硫醇的试剂

 

硫醇检测反应

1.将蛋白质样本加入Thiol Blue™（组分A）小瓶中

2.通过反复吹吸或涡旋振荡数秒混匀

3.室温下旋转或振荡反应30-60分钟

 

离心柱预处理：

1.倒置离心柱（组分C）数次重悬凝胶并去除气泡

2.折掉柱尖，将柱子插入洗涤管（2 mL，组分D）

3.取下柱盖使填充缓冲液依靠重力流至凝胶床顶部，若流速不畅，可重新盖紧柱盖后再次取下以启动流动

4.弃去流出液后将柱子放回洗涤管，若使用12×75 mm试管（需自备）则需立即离心

5.在水平转子离心机中以1,000×g离心1分钟去除填充缓冲液，弃去废液

6.加入1 mL测定缓冲液（组分B），依靠重力自然流尽或离心1分钟去除缓冲液

7.重复步骤6共3-4次

8.以1,000×g离心2分钟彻底去除反应缓冲液

提示

a.离心柱可适配2 mL微量离心管或12×75 mm试管

b.初始平衡步骤请使用配套2 mL离心管

c.需使用可产生≥1,000×g离心力的水平转子离心机

d.离心力(RCF)计算公式：RCF(g)=(1.12×10⁻⁵)×(转速RPM)²×转子半径(cm)

 

反应产物纯化：

1.将柱子移入洁净收集管（1.5 mL，组分E）

2.将100 µL反应液直接加至柱床中央

3.加样后补加10 µL测定缓冲液（组分B）

4.以1,000×g离心5分钟，收集流出液

 

吸收光谱检测（0.2 mL或0.5 mL石英比色皿）：

1.根据比色皿规格用测定缓冲液将产物稀释5倍

注：稀释倍数不影响最终硫醇定量结果

2.测定250-750 nm全波长扫描谱，或直接读取280 nm与680 nm吸光度值