Amplite 硫醇快速定量试剂盒(荧光法)绿色荧光

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产品优势

1.高灵敏度：在100 µL反应体系中可检测低至1皮摩尔（10 nM浓度）的半胱氨酸或GSH；

2.快速稳定：操作步骤简捷，结果稳定可靠；

3.灵活兼容：支持96孔板或384孔板检测模式，并可适配自动化系统；

 

适用范围

用于硫醇定量

 

产品介绍

游离硫醇（包括游离半胱氨酸、谷胱甘肽以及蛋白质中的半胱氨酸残基等）的检测与定量分析，是研究多种生物系统生理过程和生命活动的重要基础。通过监测生物样本中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽的含量变化，能够有效评估细胞和组织的氧化还原状态及解毒功能，这对于研究谷胱甘肽在抵御氧化损伤和自由基介导的细胞损伤中的保护机制具有重要意义。

半胱氨酸代谢异常会导致多种遗传性疾病，例如由溶酶体转运缺陷引起的常染色体隐性遗传病——胱氨酸贮积症，以及常见的氨基酸转运障碍疾病——胱氨酸尿症。然而目前市场上能够用于生物体系硫醇定量分析的试剂或检测试剂盒十分有限，且现有产品普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐等问题。

针对这一技术瓶颈，AAT Bioquest开发的Amplite®荧光法硫醇定量试剂盒为定量在小分子或大分子（例如蛋白质）中存在的硫醇提供了超敏的荧光测定。该试剂盒采用专利的水溶性非荧光染料，当与硫醇发生特异性反应后会生成强荧光信号，可精准定量小分子或大分子（如蛋白质）中的硫醇含量。该检测方法灵敏度极高，在100μL反应体系中可检测低至1皮摩尔（10nM浓度）的半胱氨酸或GSH，且具有操作简便、结果稳定等优势，既支持96孔板或384孔板的常规检测模式，也可轻松适配自动化检测系统。对于蛋白质硫醇基团的快速定量，我们推荐使用经过特殊优化的#5529专用试剂盒。

 

样品实验方案

简要概述

1.准备GSH工作溶液（50μL）

2.加入GSH标准品或测试样品（50μL）

3.在室温下孵育10至60分钟

4.监测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光强度变化（截止= 515 nm）

 

储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融。

GSH标准溶液（1 mM）

取GSH标准品（组分C）加入200μL ddH2 O，配制成1mM（1nmol/μL）标准溶液。

Thiolite™ Green 520WS储备液（100X）

向Thiolite™ Green 520WS（组分A）中加入100μL ddH2 O，配制成100X储备液。

 

标准品溶液梯度稀释

推荐使用在线稀释计算工具：https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/5528

操作步骤：

1.取30μL 1mM GSH标准品溶液与970μL Assay Buffer（组分B）混合，配制30μM（30pmol/μL）中间液

2.以30μM溶液为起始浓度，用Assay Buffer进行1:3连续稀释，获得7个梯度浓度标准品（SD7-SD1）

注意：稀释后的标准品溶液不稳定，需在4小时内使用

 

工作液配制方案

取50μL 100X Thiolite™ Green 520WS储备液加入5mL Assay Buffer（组分B），混匀后即为GSH工作液。

技术说明：

1.本工作液可满足1块96孔板检测需求

2.避光条件下4℃可稳定保存6小时

3.也可按比例调整储备液与缓冲液用量进行配制

 

操作步骤

表1.实心黑色96孔微孔板中GSH标准品和测试样品的布局。 SD = GSH标准品（SD1  -  SD7,0.014至10μM）; BL =空白对照; TS =测试样品

BL	BL	TS	TS
SD1	SD1	...	...
SD2	SD2	...	...
SD3	SD3
SD4	SD4
SD5	SD5
SD6	SD6
SD7	SD7

 

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
SD1-SD7	50ul	连续稀释液 (0.014 to 10 µM)
BL	50ul	分析缓冲液
TS	50ul	测试样本

 

1.按照表1和表2的布局，分别加入：GSH标准品(SD)、空白对照(BL)、测试样品(TS)。 加样体积：96孔板：每孔50μL，384孔板：每孔25μL（体积减半）

注意：细胞或组织样本需根据实验要求进行预处理

2.加入GSH工作液：96孔板：每孔50μL → 总反应体积100μL/孔；384孔板：每孔25μL → 总反应体积50μL/孔

3.室温避光孵育10-60分钟

4.荧光检测 使用荧光酶标仪检测荧光强度 检测参数设置：激发波长(Ex)：490nm，发射波长(Em)：525nm，截止波长(Cutoff)：515nm