ReadiLink 蛋白质生物素偶联试剂盒

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产品优势  

便捷性：提供完整的标记组分，操作流程简单高效

 

适用范围

主要用于标记抗体 

 

产品介绍

生物素（Biotin）被广泛应用于生物分子标记，尤其是抗体标记领域。我们的ReadiLink™蛋白生物素化试剂盒经过专门优化，可用于酶免疫分析（EIA）所需的生物素标记IgG抗体制备。该试剂盒采用琥珀酰亚胺酯化生物素（biotin succinimidyl ester）作为标记物，可与IgG及其他生物分子表面的氨基基团发生高效反应。

本试剂盒包含标记和纯化所需的全套试剂。根据我们的实验数据，每个IgG分子可偶联3-6个生物素分子（具体数量取决于IgG分子量及表面可及赖氨酸残基数量）。每盒可完成2次标记反应，每次反应最多可标记1mg蛋白。整个标记流程仅需不到1小时即可完成

样品实验方案

简要概述

将20μl反应缓冲液（组分B）加入目标蛋白（200μl）中

将蛋白质溶液添加到ReadiLink Biotin SE（组分A）中

在室温下孵育30-60分钟

通过旋转柱纯化缀合物

注意：ReadiLink™ 生物素琥珀酰亚胺酯（组分 A）：-20°C 避湿保存（开封后建议分装）

          反应缓冲液（组分 B） 和 离心柱（组分 C）：室温保存，切勿冷冻

开封前请预热所有组分，并在开始偶联前立即配制所需溶液。由于本标准操作规程 (SOP) 是为山羊抗兔 IgG 标记而制定的，您可能需要进一步优化您的蛋白标记方法。

 

工作溶液配制

蛋白质工作溶液配制方案：
为了标记1mg靶蛋白（假设目标蛋白浓度为5mg / mL），将20μ的反应缓冲液（组分B，总反应体积的10％）与200μL目标蛋白溶液混合。

注意：如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~1 mg蛋白质参与标记反应。

注意：蛋白质溶液的pH值应为8.5±0.5。若pH低于8.0，则使用反应缓冲液（组分B）或饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注意：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注意：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体可能效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得最佳标记结果。

注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。推荐将最终蛋白浓度控制在2-10 mg/mL范围内以获得理想标记效率。

 

操作步骤

1偶联反应

1.1将蛋白质工作溶液加入到ReadiLink 生物素SE（组分A）的小瓶中，通过反复移液几次将其充分混合，或者将小瓶涡旋几秒钟。

1.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。

注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

2.离心柱预处理

2.1将提供的离心柱（组分C）反转几次以重新悬浮沉降的凝胶并除去任何气泡。

2.2取下柱尖后置于洗涤管（2 mL，未提供，需自备）中。取下柱盖，让多余的填料缓冲液通过重力排放到凝胶床的顶部。如果色谱柱没有开始流动，请将盖子推回色谱柱并再次将其取出以开始流动。丢弃排出的缓冲液，然后将色谱柱放回洗涤管中。但是，如果将色谱柱放入12 x 75 mm试管（未提供，需自备）中，请立即离心。

2.3在摇动式离心机中以1,000×g离心1分钟（参见“离心注释”部分）以除去包装缓冲液。

2.4向柱中加入1-2 mL 1X PBS（pH 7.2-7.4）。每次施用PBS后，让缓冲液通过重力排出，或将柱离心2分钟以除去缓冲液。丢弃收集管中的缓冲液。重复此过程3-4次。

2.5在摇动式离心机中以1,000×g离心2分钟（参见“离心注意事项”部分）以除去包装缓冲液。

 

3.纯化偶联物

将预处理后的离心柱置于洁净收集管（1.5 mL，未提供，需自备）中，小心将100-500 µL偶联反应液加至柱床中央。追加300 µL PBS使总体积达220-520 µL，以1,000×g离心5-6分钟，收集含生物素标记蛋白的滤出液。

 

4.蛋白质偶联物的储存

建议标记抗体浓度≥0.5 mg/mL并添加保护蛋白（如0.1%牛血清白蛋白）。含2 mM叠氮钠的避光溶液可4℃保存两个月；长期保存需冻干或分装为单次用量后存于≤-60℃

 

5.离心注意事项

离心柱（组分C）可适配2 mL微量离心管或12×75 mm试管。水平转子离心机需能产生≥1,000×g离心力（注：离心力RCF=1.12×10-5×转速2×转子半径，其中半径指从转子中心到离心柱中部的距离，单位厘米）。具体转速请参照离心机说明书进行换算

 

数据分析

图1. ReadiLink 蛋白质生物素化试剂盒的化学结构