Screen Quest cAMP检测试剂盒*比色ELISA法*
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产品介绍
腺苷-3',5'-环磷酸（cAMP）是细胞内信号转导中重要的第二信使。监测cAMP水平是筛选GPCR激动剂和拮抗剂常用的方法之一。
Screen Quest™ 比色法ELISA cAMP检测试剂盒 基于HRP标记cAMP与未标记cAMP之间的竞争原理。HRP-cAMP可从HRP-cAMP/抗cAMP抗体复合物中被未标记的游离cAMP置换出来。在无cAMP存在时，HRP-cAMP结合物专一地与抗cAMP抗体结合；而当待测样品中存在未标记的游离cAMP时，其会与HRP-cAMP结合物竞争结合抗cAMP抗体，从而抑制HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。
本试剂盒为生化或细胞检测体系中腺苷酸环化酶活性的测定提供了一种灵敏的检测方法。与其他ELISA cAMP检测试剂盒相比，本试剂盒省去了繁琐的乙酰化步骤，采用 Amplite® Green 作为比色底物定量检测HRP活性。实验可在便捷的96孔或384孔微孔板中进行。
适用仪器
| 光吸收酶标仪 | |
| 推荐孔板: | 透明底板（试剂盒自带，组分F） |
样品实验方案
简要概述
- 准备样品
- 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
- 在室温下孵育5-10分钟
- 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
- 在室温下孵育3小时
- 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
- 添加100 µL /孔的Amplite Green
- 在室温下孵育1至3个小时
- 检测405、650或740 nm处的吸光度增加
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液（100 µM）：将1 mL测定缓冲液（组分B）添加到cAMP标准品（组分A）的小瓶中。
2. HRP-cAMP共轭原液（50X）：将55 µL（#36370）或550 µL（#36371）的测定缓冲液（组分B）添加到HRP-cAMP偶联物（组分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样，并在-20℃下保存。
3.洗涤液（1倍）：将1 mL的10X洗涤溶液（组分D）添加到9 mL蒸馏水中。
标准溶液配制
在分析缓冲液（组分B）中对cAMP标准品进行1：10、1：100和1：3的系列稀释，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀释溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶联物工作溶液：
在使用前，用测定缓冲液（组分B）以1:50稀释，使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点； 准备适当的体积，仅供一次性使用，现配现用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞：
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例：吸出细胞生长培养基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO2，37°C恒温箱，放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液，加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液（组分E），然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定，也可以在测定缓冲液（组分B）中稀释后测定。
注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。细胞可以在实验的前或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本：
由于组织中环状核苷酸的快速代谢，重要的是在收集后快速冷冻组织（例如，使用液氮）。称重冷冻的组织，并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液，血浆和培养基样品：
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1：200至1：1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1：200的稀释度测试培养基。
注意：RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备：A）cAMP标准品，对照或测试样品； B）HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（组分F）的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上，在室温下孵育3小时。
2.4吸出板内容物，并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Green（组分G），并在避光的情况下在室温下孵育60分钟至3小时。
2.6使用光吸收酶标仪检测在405 nm，650 nm或740 nm处的吸光度增加。
