Screen Quest cAMP检测试剂盒*荧光ELISA法*
| Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 584 |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | - |
产品货期
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适用范围
用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）系统中腺苷酸环化酶的激活
产品介绍
Screen Quest™ 荧光法ELISA cAMP检测试剂盒 提供了一种优化的检测方法，用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）系统中腺苷酸环化酶的激活。该试剂盒基于HRP标记cAMP与未标记cAMP之间对有限数量抗体结合位点的竞争原理。HRP-cAMP可从HRP-cAMP/抗cAMP抗体复合物中被未标记的游离cAMP置换出来。在无cAMP存在时，HRP-cAMP结合物专一地与抗cAMP抗体结合；而当待测样品中存在未标记的游离cAMP时，其会与HRP-cAMP结合物竞争结合抗cAMP抗体，从而抑制HRP-cAMP与抗cAMP抗体的结合。
本试剂盒为检测腺苷酸环化酶活性提供了一种灵敏的方法。与其他市售ELISA cAMP检测试剂盒相比，本试剂盒在显色步骤前仅需一次洗涤步骤即可去除未结合物质，同时省去了繁琐的乙酰化操作。试剂盒采用 Amplite® Red 作为荧光HRP底物来定量检测HRP活性，所形成的荧光产物与HRP-cAMP结合物的活性成正比。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 前任： | 540nm |
| 嗯： | 590nm |
| 隔断： | 570nm |
| 推荐孔板: | 纯黑色孔板（试剂盒自带，组分H） |
样品实验方案
简要概述
- 准备样品
- 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
- 在室温下孵育5-10分钟
- 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
- 在室温下孵育2小时
- 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
- 添加100 µL /孔的Amplite Red
- 在室温下孵育15至60分钟
- 检测Ex / Em = 540/590 nm时的荧光增加
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液（100 µM）：将1 mL测定缓冲液（组分B）添加到cAMP标准品（组分A）的小瓶中。
注意：应将未使用的cAMP储备溶液（100 µM）等分并保存在-20℃下。
2. HRP-cAMP偶联物原液（50X）：将55 µL（#36373）或550 µL（#36374）的测定缓冲液（组分B）添加到HRP-cAMP偶联物（组分C）的小瓶中。
注意：未使用的50X HRP-cAMP偶联物原液应分为一次性使用的等分试样，并在-20℃下保存。
3.洗涤液（1倍）：将1 mL的10X洗涤溶液（组分D）添加到9 mL蒸馏水中。
4. Amplite Red储备液（200X）：将50 µL（#36373）或500 µL（#36374）的DMSO加入到Amplite Red（组分G）的小瓶中。
注意：0.5 µL 200X Amplite Red储备液足以用于一个测定点。 应将未使用的再生原液分装并储存在-20℃。
工作溶液配制
1. HRP-cAMP工作溶液：在使用前，用测定缓冲液（组分B）以1:50稀释，使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。
注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点； 准备适当的体积，仅供一次性使用。
2. Amplite Red工作溶液：向10 mL底物缓冲液（组分I）中加入50 µL Amplite Red储备溶液（200X）和11.5 µL 3％H2O2（组分F）
注意：Amplite Red工作溶液不稳定，请立即使用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞：
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例：吸出细胞生长培养基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO2，37°C恒温箱，放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液，加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液（组分E），然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定，也可以在测定缓冲液（组分B）中稀释后测定。注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。细胞可以在实验的前或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本：
由于组织中环状核苷酸的快速代谢，重要的是在收集后快速冷冻组织（例如，使用液氮）。称重冷冻的组织，并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液，血浆和培养基样品：
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1：200至1：1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1：200的稀释度测试培养基。注意：RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备：A）cAMP标准品，对照或测试样品； B）HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（组分F）的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上，在室温下孵育2小时。
2.4吸出板内容物，并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Red工作溶液，并在避光的条件下在室温下孵育10分钟至2小时。
2.6通过使用荧光酶标仪（顶部读取模式），检测Ex / Em = 540/590 nm（截止570 nm）处的荧光增加。
