Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*
| Ex (nm) | - | Em (nm) | - |
| 分子量 | - | 溶剂 | - |
| 存储条件 | 在2-8度冷藏保存, 避免光照 |
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产品介绍
Screen Quest™ TR-FRET 免洗 cAMP 检测试剂盒 提供了一种便捷的检测方法，用于监测 G 蛋白偶联受体（GPCR）系统中腺苷酸环化酶的激活。与其他市售 ELISA cAMP 检测试剂盒相比，本均相检测试剂盒无需洗涤步骤，也无需乙酰化操作。
该试剂盒基于 trFluor™ 650 标记的 cAMP 示踪物 与 未标记的游离 cAMP 之间对有限数量抗 cAMP 抗体结合位点的竞争原理。抗 cAMP 抗体由 trFluor™ Eu 标记，而 cAMP 示踪物由 trFluor™ 650 标记。在无 cAMP 存在时，trFluor™ 650-cAMP 结合物专一地与 trFluor™ Eu 标记的抗 cAMP 抗体结合，产生强烈的 FRET 信号。而当待测样品中存在未标记的游离 cAMP 时，其会与 trFluor™ Eu 标记的抗 cAMP 抗体结合物竞争结合位点，从而抑制 trFluor™ 650-cAMP 与抗 cAMP 抗体的结合。
trFluor™ 650 标记的 cAMP 示踪物仅具有纳秒级的荧光寿命，而与 trFluor™ Eu 标记抗 cAMP 抗体结合的示踪物则具有镧系荧光团特有的更长荧光寿命。时间分辨荧光信号（TR-FRET）的强度与样品中 cAMP 的浓度成正比。
本试剂盒可在便捷的 96 孔或 384 孔微孔板中进行，适用于 GPCR 系统中 cAMP 活性的监测，具有高特异性和高灵敏度。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 推荐孔板: | 纯黑色/黑色透明底板 |
| 分析方式: | 时间分辨荧光分析 |
样品实验方案
溶液配制
储备溶液配制
cAMP标准（1mM）：将100 µL稀释剂（组分E）添加到cAMP标准品（组分C）中，并充分混合。
注意：未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。
工作溶液配制
1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液：将55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）加到Anti cAMP-trFluor Eu（组分A）小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。
2. cAMP-trFluor 650工作溶液：在cAMP-trFluor 650小瓶（组分B）中加入55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。
实验步骤
1.细胞制备：
1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。
1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中，在96孔板中培养。 实验前，将板以800 rpm的速度离心2分钟。
1.3根据需要处理细胞：以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞，在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO2、37℃恒温箱中孵育15分钟。
注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。 细胞可以在实验的前或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准（CS1-CS7）; BL =空白对照； TS =测试样品。
| BL | BL | TS | TS |
| CS1 | CS1 | ... | ... |
| CS2 | CS2 | ... | ... |
| CS3 | CS3 | ||
| CS4 | CS4 | ||
| CS5 | CS5 | ||
| CS6 | CS6 | ||
| CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成。
| 孔 | 容积 | 试剂 |
| CS1-CS7 | 25 µL | 连续稀释 |
| BL | 25 µL | 稀释剂（组分E） |
| TS | 25 µL | 测试样品 |
2.细胞裂解物中的cAMP测定
2.1根据表1和表2提供的布局，准备并添加cAMP标准品（CS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。
注意：测试样品可以是非刺激或刺激的样品。
2.2在cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液（化合物重悬于缓冲液中），以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为25 µL /孔。
2.3将反应在室温下孵育30分钟。
2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为37.5 µL /孔。
注意：对于阴性对照，可以添加裂解缓冲液。
2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，在每个孔中加入12.5 µL工作溶液，总体积为50 µL。
2.6将反应在室温下孵育30分钟。
2.7在兼容的TR-FRET（时间分辨荧光分析仪）上检测。
表3.方案总结
|
cAMP标准 |
细胞 |
||||
|
负控制 |
正控制 |
标准曲线 |
负控制 |
非刺激 |
刺激 |
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25 µL稀释剂 |
25 µL稀释剂 |
25 µL标准液 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
|
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL化合物 |
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在室温孵育30分钟 |
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25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
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25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液 |
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在室温孵育30分钟 |
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表4.兼容的仪器汇总
| 制造商 | 仪器 |
| Berthhold Technologies | Tristar2 S; Mithras LB 940; Mithras2 LB 943 |
| Hidex | Sense; Sense Beta Plus |
| Molecular Devices | Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3 |
| Thermo Scientific | Varioskan Lux |
| Biotek | Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2 |
| BMG Labtech | PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega |
| Tecan | Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro |
