百萤推荐:AAT钙离子荧光探针Calbryte系列产品
本周,百萤生物为大家推荐的是AAT Bioquest研发生产的 亮的钙离子荧光探针Calbryte系列产品(代表产品:Calbryte 520、Calbryte 590 、 Calbryte 630)。Calbryte 系列是开发用于检测细胞内钙离子的荧光染料家族。这些指示剂的主要区别在于它们的激发和发射波长,它们均可以使用标准的荧光仪器进行检测。Calbryte 系列已经经过优化,可用于荧光显微镜、荧光酶标仪和流式细胞仪,它们还可以用于高通量筛选应用。感兴趣的朋友一起来看看吧!
Calbryte 系列染料与常见的Fluo-3和Fluo-4染料相比具有几个关键优势 。Calbryte 系列染料能产生更亮的信号,具有更 的信噪比,并大大增强了细胞保留能力。这些特点使Calbryte 系列染料成为传统的钙指示剂的 替代品。
图1.在Fluo-4,AM(左)和Calbryte 520AM(右)的CHO-K1细胞中测量ATP反应。将CHO-K1细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔在黑色96孔板中接种过夜。加入含丙磺舒的HH缓冲液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte 520 AM或含丙磺舒的HH缓冲液中的10 µg / ml Fluo-4,AM,并在37°C下孵育45分钟。然后除去染料加载溶液,并用200 µL HH Buffer /孔替换。加入ATP(50 µL /孔)以达到 终指示的10 µM浓度,然后用显微镜FITC通道(Keyence)成像。
Calbryte系列产品的命名
Calbryte 系列的染料是根据其 大发射波长命名的。例如,Calbryte 520在可见光谱的绿色区域发出荧光,而Calbryte 590和Calbryte 630在红色和深红色区域发出荧光。它们共有AM酯形式、盐形式(以钾盐形式)。AM酯形式是可渗透细胞的形式,可用于检测活细胞中的钙离子。盐形式主要用于校准钙指示剂。根据荧光信号强度计算细胞内钙浓度时,通常需要执行此步骤。盐形式的Calbryte 也可以用于向活细胞和组织中进行显微注射。
Calbryte系列产品在活细胞中的作用机制
当测定活细胞中的钙离子时, 方法是合成具有几个乙酰氧基甲基酯(AM酯)官能团的Calbryte 染料。这样做的原因有两个。首先,AM酯是亲脂性基团,当连接到Calbryte 核心结构时,会形成整体上更疏水的化合物。这种增加的疏水性使Calbryte AM酯易于渗透完整的脂质膜并渗透到活细胞中。这 了对电穿孔、显微注射或其他类似破坏性加载技术的需求;其次,Calbryte 染料虽然呈AM酯形式,但基本上是非荧光性且不可活化的。它们对存在于细胞外溶液中的微量Ca2+表现出 小的响应。只有当Calbryte 探针渗透到细胞中,并且只有在细胞内酯酶切割掉AM酯官能团之后,Calbryte 染料才被 并对钙离子有反应。这两步 过程非常重要,因为它极大地减少了非特异性背景荧光。并且通过扩展,它明显增强了细胞内钙离子信号; 后,一旦 了Calbryte 探针,它就会通过典型的螯合过程检测细胞中钙的钙离子。但是,与其他螯合剂(例如Fluo-3和Fluo-4)不同,Calbryte 染料在与钙结合时会表现出更大的响应。在实验中,Calbryte 探针在螯合后会表现出大于300倍的荧光增加。相比之下,Fluo-4仅表现出100倍的增长。荧光响应的这种明显 ,使这种新型钙离子检测探针Calbryte对钙的检测极为稳定,这是过去的钙指示剂无法实现的。
Calbryte系列产品的优势
在活细胞实验中,Calbryte 染料的信噪比比其他染料(例如Fluo-4)大一个数量级,在实验研究中,这是一个巨大的优势,因为较差的信噪比对数据分析来说是非常头疼的问题。它将结果与其他信号混在一起,可能会遗失掉许多重要数据,并导致巨大的测定差异。因此,在选择试剂时,大多数研究人员更喜欢信噪比高的试剂。
信噪比不佳可能是由多种因素造成的,这些因素主要分为两类。第一类,存在导致信号强度差的因素。这些可以包括:
- 低消光系数和量子产率
- 与目标结合不佳
- 远离激发光源的 大吸光度(λmax)
Catbryte 系列染料的开发, 的解决了以上问题。例如,Calbryte 520的量子产率是Fluo-3和Fluo-4的三倍。这意味着Calbryte 520吸收的每个光子从根本上比Fluo-3或Fluo-4发出更多的荧光,从而产生更亮的荧光信号。此外,所有Calbryte 系列染料的设计均应使其 大吸收率发生在标准激发源附近。例如,Calbryte 520(λmax = 492 nm)被常见的488 nm氩离子激发光线激发。
许多探针表现出较差的信噪比的第二个原因是由于高背景。高背景可能是由于以下原因造成的:
- 细胞不渗透
- 高自发荧光
- 非特异性 /结合
- 细胞内保留性差
这些因素中的许多与探针进入细胞并有效定位于细胞质的能力有关。纵观过去的许多钙指示剂,它们经常遇到两个问题:1.探针要么是相当水溶性的,但太亲水而不能渗透活细胞,要么是疏水性足够渗透活细胞,但水溶性太差,在加载过程中会从溶液中沉淀出来,这两种情况都不可取。Calbryte 系列荧光染料通过控制水溶性官能团和前面提到的AM酯基来解决这个问题,通过优化,Calbryte 染料能够获得更高的信噪比。
图3.CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。将CHO-K细胞以每100 µL 40,000个细胞的孔接种在黑色96孔板中过夜。将含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 520 AM(左),Calbryte 590 AM(中)或Calbryte 630 AM(右)加入孔中,并将细胞在37°C下孵育1小时。将染料加载介质替换为200 µL HHBS,用50 µL 50 µM ATP处理,并使用FITC通道(Calbryte 520),TRITC通道(Calbryte 590)或Texas Red通道Calbryte 630),用荧光显微镜成像(Keyence)。
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