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荧光鬼笔环肽:可视化肌动蛋白丝的实用染色

肌动蛋白是形成微丝高度保守的蛋白质家族。在从酵母到高等真核生物(如人)之间,其氨基酸序列变化小于20%。由于其在真核细胞中的细胞内丰度很高,在微摩尔浓度之内,因此肌动蛋白对蛋白与蛋白的相互作用的参与率最高。它具有从单体状态动态聚合成丝状肌动蛋白(F-actin)的独特能力。F-肌动蛋白与调节蛋白(例如肌动蛋白结合蛋白)之间的相互作用会迅速组装和拆卸肌动蛋白丝,将它们组织成肌动蛋白束和细胞骨架网络。这些高阶结构为许多细胞过程提供了必要的机械和结构支持,包括细胞内转运,胞质分裂,细胞运动,极性和细胞形状,基因调控和信号转导。由于肌动蛋白在许多生物学过程中必不可少,因此研究这些肌动蛋白结构的工具(肌动蛋白特异性抗体和鬼笔环肽衍生的染色剂)必不可少。


肌动蛋白特异性抗体:最早的F-肌动蛋白染色剂

最早的肌动蛋白染色技术通过采用荧光团标记的抗体对肌动蛋白微丝进行染色,采用了免疫组织化学(IHC)方法(Lazarides和Weber,1974)。虽然此方法在功能上可用于肌动蛋白可视化,但仍有缺点存在。

缺点1,免疫染色需要很大的工作量。它需要仔细考虑参数,包括抗体选择,固定,抗原回收和阻断等。如果所需的抗体不是市售的,则需要额外的时间和成本来开发和纯化合适的抗体。

缺点2,抗体的利用可能是一个阻碍。通常空间尺寸较大(约150 kDa)的抗体不能渗透细胞膜,需要在肌动蛋白染色之前对细胞进行固定和透化。正确的固定至关重要,并且取决于表位敏感性和所使用的抗体。固定保留了细胞结构,但可以降低某些细胞区室的抗原性。因此,必须优化固定条件,因为固定不足或过度固定会大大降低或阻止组织免疫反应。

缺点3,抗体偶联物与单体和聚合肌动蛋白非特异性结合会产生高背景,从而导致低分辨率的染色。为了打破这种局限性,我们开发了对F-肌动蛋白具有增强特异性的新型肌动蛋白结合成分,作为合适的替代品。其中最引人注目的是鬼笔环肽。


鬼笔环肽

鬼笔环肽的化学结构* CAS#:17466-45-4 *(货号5301)。

鬼笔环肽是鬼笔毒素家族的主要代表,是一种双环七肽,从有毒的死亡帽蘑菇伞形毒蕈中分离出来。它对F-肌动蛋白亚基之间的凹槽比单体G-肌动蛋白更具有亲和力。一旦与F-肌动蛋白结合,鬼笔环肽就会使单体和长丝的平衡向长丝位置移动,并抑制ATP水解。相互作用通过防止亚基解离来稳定肌动蛋白丝,并通过降低临界浓度促进肌动蛋白聚合。结果,这些特性使得鬼笔环肽衍生物成为可视化F-肌动蛋白和细胞骨架网络的经典染色剂。

 

鬼笔环肽衍生物的性质

自从1970年代末首次使用它对肌动蛋白进行染色以来,鬼笔环肽及其荧光衍生物一直是可视化细胞肌动蛋白丝的金标准。与IHC染色相比,鬼笔环肽衍生物在标记肌动蛋白方面具有明显优势。它们为鉴定,标记和定量固定和透化的细胞和组织切片中的F-肌动蛋白形成提供了一种方便的方法。

鬼笔环肽衍生物是水溶性的,当以纳摩尔浓度使用时,可以选择性地染色F-肌动蛋白。与某些抗肌动蛋白的抗体不同,鬼笔环肽与肌动蛋白丝更紧密地结合在单体上的能力会降低非特异性染色和背景噪音,从而在染色区域和未染色区域之间产生高对比度。与抗体相比,鬼笔环肽衍生物小(<2 kDa),与鬼笔环肽结合的细丝不妨碍细丝的功能特性。小尺寸还允许进行更密集的F-肌动蛋白标记,以更高的分辨率成像时会产生更详细的污点。此外,由于肌动蛋白在进化上是保守的,因此鬼笔环肽衍生物的结合特性可用于对各种动植物细胞进行染色。

 

正确选择鬼笔环肽衍生物是试验成功的第一步

1.未标记的鬼笔环肽: 未标记的鬼笔环肽用途有限。除了用作肌动蛋白聚合的促进剂外,未标记的鬼笔环肽通常用作阻断F-肌动蛋白染色的对照。

2.生物素化鬼笔环肽: 生物素化的鬼笔环肽提供了一种可视化和定量肌动蛋白丝的间接方法。它需要使用荧光或酶结合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素进行可视化操作。虽然间接检测具有信号放大的优势,但对其他试剂的需求却增加了成本和测定时间。另外,当用生物素化的鬼笔环肽染色时,需要更高浓度的鬼笔环肽缀合物,大约是荧光鬼笔环肽的两倍。虽然有缺点,但生物素化的鬼笔环肽都适合用于pull-down实验和免疫沉淀分析,用以研究蛋白质相互作用以及F-肌动蛋白的共定位等。

图示:A)用F-肌动蛋白染色的鬼笔环肽iFluor 488(货号23115)标记CPA细胞,并与溶酶体染料LysoBrite Red(货号22645)和细胞核染料Nuclear Blue DCS1(货号17548)共同染色;B)用F-肌动蛋白染料鬼笔环肽-iFluor 350(货号23110)标记HeLa细胞,并与细胞核染料Nuclear Red DCS1(货号17552)共同染色;C)用F-肌动蛋白染料鬼笔环肽-iFluor 555(货号23119)标记HeLa细胞。与线粒体染色剂MitoLite Green(货号22695)和细胞核染料Nuclear Blue DCS1(货号17548)和质膜染色剂Cellpaint 深红色(货号22681 )共同染色。

3.荧光鬼笔环肽-iFluor 缀合物: 利用我们的iFluor 染料出色的荧光特性,AAT Bioquest开发了一系列覆盖整个色谱的鬼笔环肽缀合物,它们选择性地与F-肌动蛋白结合。这些iFluor 鬼笔环肽衍生物以纳摩尔浓度使用,可方便用于许多肌动蛋白相关的测定。此类测定包括标记、鉴定和定量用甲醛固定和透化的组织切片中的F-肌动蛋白,细胞培养或无细胞实验。与传统的异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明缀合物相比,鬼笔环肽-iFluor 缀合物具更高的荧光强度和光稳定性。鬼笔环肽-iFluor 700、iFluor -750和iFluor -790缀合物是少数几种可用的近红外染料,可与常用的红色荧光团进行光谱分离。


用鬼笔环肽-iFluor 缀合物染色F-肌动蛋白

图示:A)用鬼笔环肽-iFluor 488染色(货号23115)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察。将细胞固定在4%甲醛中,并与线粒体染料MitoLite Red FX600(货号22677)和Nuclear Blue DCS1(货号17548)染色;B)用鬼笔环肽-iFluor 514(货号23116)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察。固定的细胞用Nuclear Blue DCS1(货号17548)染色;C)用鬼笔环肽-iFluor 532(货号23117)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察。固定的细胞用Nuclear Green DCS1(货号17550)染色;D)用鬼笔环肽-iFluor 647(货号23127)染色的HeLa细胞的荧光图像,并使用配备Cy5滤光片组的荧光显微镜观察。首先用线粒体染料MitoLite Green(货号22675)对活细胞进行染色。在4%甲醛中固定后,细胞用鬼笔环肽-iFluor 647标记,并用Nuclear Blue DCS1(蓝色,货号17548)染色。


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货号 产品名称 规格 价格
5301 鬼笔环肽* CAS#:17466-45-4 * 1毫克 2340
5302 鬼笔环肽胺 100微克 2340
23100 鬼笔环肽-AMCA标记 300Tests 1740
23101 鬼笔环肽-荧光素标记 300Tests 1740
23102 鬼笔环肽-罗丹明标记 300Tests 1740
23103 鬼笔环肽-加州红标记 300Tests 1740
23110 鬼笔环肽-iFluor 350标记 300Tests 1740
23111 鬼笔环肽-iFluor 405标记 300Tests 1740
23115 鬼笔环肽-iFluor 488标记 300Tests 1740
23116 鬼笔环肽-iFluor 514标记 300Tests 1740
23117 鬼笔环肽-iFluor 532标记 300Tests 1740
23119 鬼笔环肽-iFluor 555标记 300Tests 1740
23122 鬼笔环肽-iFluor 594标记 300Tests 1740
23125 鬼笔环肽-iFluor 633标记 300Tests 1740
23127 鬼笔环肽-iFluor 647标记 300Tests 1740
23128 鬼笔环肽-iFluor 680标记 300Tests 3540
23129 鬼笔环肽-iFluor 700标记 300Tests 3540
23130 鬼笔环肽-iFluor 750标记 300Tests 3540
23131 鬼笔环肽-iFluor 790标记 300Tests 3540
23150 鬼笔环肽-AF350标记(升级版:鬼笔环肽-iFluor 350标记) 300Tests 3540
23153 鬼笔环肽-AF488标记(升级版:鬼笔环肽-iFluor 488标记) 300Tests 3540
23158 鬼笔环肽-AF594标记(升级版:鬼笔环肽-iFluor 594标记) 300Tests 3540

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