Amplite 比色法乙酰胆碱酯酶检测试剂盒

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适用范围

用于乙酰胆碱酯酶检测

 

产品介绍

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是一种通过水解作用降解神经递质乙酰胆碱的酶，其催化产物为胆碱和乙酰基。该酶主要分布于神经肌肉接头和中枢神经系统的胆碱能突触中，通过快速终止突触传递发挥关键生理功能。AChE具有极高的催化效率——单个酶分子每秒可降解约5000个乙酰胆碱分子。此外，AChE还存在于红细胞膜表面，构成Yt血型抗原系统。该酶存在多种分子形式，这些亚型虽具有相似的催化特性，但在寡聚体组装方式和细胞膜附着模式上存在差异。

Amplite®比色法乙酰胆碱酯酶检测试剂盒提供了一种便捷的AChE活性检测方案。其检测原理是：AChE催化乙酰硫胆碱水解生成硫代胆碱，通过DTNB显色剂对硫代胆碱进行定量检测。DTNB加合物的吸光度强度与硫代胆碱生成量（即AChE活性）呈正相关。

 

适用仪器

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光吸收酶标仪
吸收:	410 ± 5nm
推荐孔板:	透明孔板

96孔板测定示例

概述

准备AChE反应混合物（50μL）

加入AChE标准品或AChE测试样品（50μL）

在室温下孵育10-30分钟监测410±5 nm的吸光度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

 

操作方法

1.准备库存解决方案：

1.120X DTNB储备溶液：将0.6mL测定缓冲液（组分B）加入到DTNB（组分A）的小瓶中以制备20X DTNB储备溶液。

注意：未使用的DTNB储备溶液应分为单次使用的等分试样。 储存在-20℃并避光。

1.220X乙酰硫代胆碱储备溶液：将0.6mL ddH 2 O加入乙酰硫代胆碱的小瓶中（组分C）。

注意：未使用的20X乙酰硫代胆碱原液应分成一次性等分试样，并在20℃下保存。

1.3乙酰胆碱酯酶储备液：将100μLDdH2O与0.1％BSA加入乙酰胆碱酯酶标准品（组分D）中，制成50单位/ mL乙酰胆碱酯酶储备液。

注意：未使用的乙酰胆碱酯酶原液应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

 

2.制备乙酰硫代胆碱反应混合物：

根据说明书中表1制备乙酰硫代胆碱反应混合物并避光。

Components	Volume
Assay Buffer (Component B)	4.5 mL
20X DTNB Stock Solution (from Step 1.1)	250 mL
20X Acetylthiocholine Stock solution (from Step 1.2)	250 mL
Total volume	5 mL

 

3.准备连续稀释的乙酰胆碱酯酶标准品（0至1000 mU / mL）：

3.1将20μL的50单位/ mL乙酰胆碱酯酶储备液（来自步骤1.3）加入到980L的测定缓冲液（组分B）中以产生1000mU / mL乙酰胆碱酯酶标准溶液。

注意：稀释的乙酰胆碱酯酶标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL1000mU / mL乙酰胆碱酯酶标准品进行1：3连续稀释，得到300,100,30,10,3,1和0 mU / mL连续稀释的乙酰胆碱酯酶标准品。

3.3如说明书中表2和3中所述，将含有乙酰胆碱酯酶标准品和含乙酰胆碱酯酶的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意：根据需要处理细胞或组织样本。

 

4.运行乙酰胆碱酯酶测定：

4.1将50μL乙酰硫代胆碱反应混合物（来自步骤2.1）加入乙酰胆碱酯酶标准品，空白对照和测试样品（见步骤3.3）的每个孔中，使总乙酰胆碱酯酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL乙酰硫代胆碱反应混合物。

4.2在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

4.3使用吸光度酶标仪在410±5 nm处检测吸光度的增加。