Amplite 荧光法乙酰胆碱检测试剂盒 红色荧光

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适用范围

用于乙酰胆碱酯酶检测

 

产品介绍

乙酰胆碱及其代谢产物主要具有三大生理功能：1）维持细胞膜结构完整性及信号转导功能；2）参与胆碱能神经传递（乙酰胆碱合成过程）；3）通过其代谢产物三甲基甘氨酸（甜菜碱）为S-腺苷甲硫氨酸合成途径提供甲基基团。作为乙酰胆碱和膜磷脂酰胆碱的前体物质，乙酰胆碱在中枢神经系统中发挥着关键作用。

Amplite®荧光法乙酰胆碱检测试剂盒采用目前最灵敏的检测技术之一，通过胆碱氧化酶介导的级联酶反应，利用Amplite® Red™荧光探针实现乙酰胆碱定量检测，其荧光强度与乙酰胆碱浓度成正比。该试剂盒为神经科学研究提供了高灵敏度的检测方案。

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

样品实验方案

简要概述

1.准备ACh工作溶液（50μL）
2.添加ACh标准品或ACh测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测Ex / Em = 540/590 nm处的荧光强度（截止= 570 nm）

 

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融。
1. Amplite 红色储备液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red（组分A）的小瓶中以制备250X Amplite Red原液。

2.乙酰胆碱标准溶液（50 mM）：
将200μLddH₂O加入到乙酰胆碱标准品（组分C）的小瓶中以制备50mM乙酰胆碱标准溶液。

 

2.标准溶液

乙酰胆碱标准
将20μL50mM乙酰胆碱标准溶液加入到980μL测定缓冲液（组分D）中以产生1000μM乙酰胆碱标准溶液。 取1000μM乙酰胆碱标准品，在分析缓冲液（组分D）中进行1:10，得到100μM乙酰胆碱标准品（AS7）。 取100μM乙酰胆碱标准品（AS7）和1：3连续稀释液，用分析缓冲液（组分D）连续稀释乙酰胆碱标准品（AS6-AS1）。

注意：稀释的乙酰胆碱标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

 

3.工作溶液

1.将5mL测定缓冲液（组分D）加入乙酰胆碱探针（组分B）瓶中并充分混合。

2.将20μL250XAmplite Red 储备溶液加入乙酰胆碱探针溶液瓶中，制成乙酰胆碱（ACh）工作溶液。

注意：应立即使用乙酰胆碱（ACh）工作溶液并避光。 测定背景将随着更长的储存时间而增加。

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样品分析

表1.实心黑色96孔微孔板中乙酰胆碱标准品和测试样品的布局。 AS =乙酰胆碱标准品（AS1-AS7,0.14至100μM）; BL =空白对照; TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
AS1	AS1	...	...
AS2	AS2	...	...
AS3	AS3
AS4	AS4
AS5	AS5
AS6	AS6
AS7	AS7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
AS1-AS7	50ul	连续稀释液（0.14至100μM）
BL	50ul	分析缓冲液
TS	50ul	测试样本

1.根据表1和2中提供的布局制备乙酰胆碱标准品（AS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。

注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.向乙酰胆碱标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μL乙酰胆碱（ACh）工作溶液，使总乙酰胆碱测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μL乙酰胆碱（ACh）工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至30分钟，避光。

4.用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的荧光酶标仪监测荧光增加。