DiD荧光染料在肝前体细胞追踪中的应用

一、文献中DiD染料的检测目的与方法

1.检测目的：

   a：人胎肝前体细胞（fHPCs）：通过磁分选技术分离EpCAM（上皮细胞黏附分子）阳性细胞（纯度49±23%）。

   b：细胞体内命运：移植后细胞的存活、定位、分化及对肝功能的修复作用。

2.标记方法：

   a.细胞标记

       将DiD染料（5 μL）与磁分选后的EpCAM⁺细胞（1×10⁶/mL）在37°C孵育20分钟。

       洗涤3次去除游离染料（使用Hank's缓冲盐溶液）。

   b.动物模型：

       慢性肝病（CLD）SCID小鼠模型（四氯化碳诱导肝损伤）。

       移植方式：将DiD标记细胞直接注射到小鼠肝叶（单点注射，26G针头）。

   c.活体成像：

       设备：Carestream-KODAK Multispectral FXPRO荧光成像系统。

       参数：激发波长630 nm，发射滤光片670/30 nm。

       时间点：移植后7、15、30、45、60及80天。

   d.验证技术：

       离体成像：取肝组织验证DiD信号定位（图3D）。

       免疫荧光：检测肝标志物（CK、c-Met、人白蛋白）与DiD共定位（图4-7）。

       分子检测：人特异性Alu序列PCR（移植后80天仍检出）。

       功能评估：血清转氨酶（SGOT/SGPT）和胆红素水平分析。

二、DiD染料的优势：文献数据支持

1.长时间追踪能力：

   DiD信号在移植后80天仍可检测（图3B），远超其他染料

   信号稳定无光漂白，适合长期研究。

2.高兼容性与低背景干扰：

   近红外发射（670 nm）：最小化组织自发荧光（图3C，非移植组无信号）。

   多色复用：可与FITC等荧光素共用（如EpCAM-FITC分选后共染CK/c-Met）。

3.安全性及细胞相容性：

   未影响fHPCs分化功能：移植细胞表达肝细胞标志物（CK、c-Met、白蛋白），并改善肝功能（图6A）。

   无染料转移至宿主细胞（文献对比PKH26存在转移风险）。

4.操作简便

   20分钟标记流程，无需基因改造（与报告基因法的安全性隐患）。

三、使用DiD的实践建议

1.优化标记条件

   浓度：推荐2 μM以下（文献使用5 μL原液，未报告细胞毒性）。

   孵育时间：20–30分钟（37°C）。

2.成像注意事项

   背景控制：剃除实验动物腹部毛发以减少自发荧光（图3C）。

   定量局限：需结合PCR/免疫染色验证细胞存活（如Alu序列检测）。

3.替代方法对比

四、总结

本研究证实DiD是长时程活体细胞追踪的理想工具，尤其适用于干细胞治疗领域：

   80天的稳定信号为机制研究提供时间窗口；

   非侵入性成像降低动物实验复杂度；

   兼容多功能验证（分子/组织学/生化分析）。

推荐在肝再生、肿瘤转移及神经发育研究中优先采用DiD方案，以突破传统追踪技术的时效与安全性限制。

文献支持：Tripura C et al. World J Hepatol. 2022;14(10):1884-1898. doi:10.4254/wjh.v14.i10.1884.