荧光素酶与D-荧光素钾盐：生物发光领域的黄金搭档

萤火虫荧光素酶（学名：Photinus-luciferin:oxygen 4-oxidoreductase，EC 1.13.12.7）通过ATP依赖的荧光素氧化反应产生光信号。该反应在560 nm波长处产生的化学发光信号可在数秒内达到峰值。当底物过量时，光输出强度与荧光素酶浓度呈正比。萤火虫荧光素酶的luc基因，作为重要的报告基因广泛应用于：植物、细菌、哺乳动物细胞的基因表达研究，以及昆虫中杆状病毒基因表达的监测。由于化学发光技术具有近乎零背景的特性，luc报告基因特别适用于检测低水平基因表达。
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D-荧光素钾盐：是萤火虫荧光素酶催化反应的关键底物。在 ATP（三磷酸腺苷）、Mg²⁺（镁离子）和 O₂（氧气）存在的条件下，萤火虫荧光素酶能够特异性地催化 D - 荧光素钾盐发生氧化脱羧反应。这一反应过程十分复杂且精妙，最终会产生蓝绿色荧光，其平均波长为 560nm 。

反应发光原理图

不同种类荧光素酶的发光反应

萤火虫荧光素酶（Fluc）、海肾荧光素酶（Rluc）和高斯荧光素酶（Gluc）的生物发光反应。（图中）展示了荧光素的化学结构，以及每种荧光素酶对应的化学反应和最大发光峰值（λmax）。

一、核心优势，为何选择D-荧光素钾盐

1.超高灵敏度，突破检测极限

   a.在ATP和氧气存在下，D-荧光素钾盐与荧光素酶反应释放560 nm黄绿光，信号强度可达传统荧光染料的1000倍以上，可检测低至单细胞水平的基因表达动态。
   b.零背景干扰：化学发光无需激发光源，彻底规避自发荧光和光漂白问题，尤其适用于活体动物成像和深层组织检测。

2.快速响应，动态追踪生命过程

   反应在数秒内达到峰值，支持实时监测肿瘤生长、病毒感染、基因治疗等动态过程，时间分辨率精确至分钟级。

3.广泛兼容性，赋能多场景研究

   a.适配体外检测（如报告基因分析、高通量药物筛选）和活体成像（小鼠、斑马鱼等模型），覆盖分子生物学、细胞生物学、转化医学全链条需求。
   b.与主流仪器兼容：适用于IVIS Spectrum、LI-COR等成像系统，并支持微孔板读数器自动化检测。

二、D-荧光素底物（钠盐/钾盐等），生命科学研究的多面手

荧光素酶主要用于生物发光成像（BLI），以下是一些比较经典的研究方向及文献：

1.基因表达成像

用于研究转录和转录后水平的基因表达调控。在转录水平，通过构建顺式转录报告系统，分析启动子区域突变或转录因子结合位点对荧光素酶表达的影响；在转录后水平，可研究 mRNA 稳定性、RNA 干扰（RNAi）和微小 RNA（miRNA）功能。文献链接：https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpgi.00602.2007

2.蛋白质 - 蛋白质相互作用成像

常用双杂交系统和分裂报告系统。双杂交系统利用转录激活因子的结构特点，通过蛋白质相互作用使转录激活因子结合启动子，驱动荧光素酶表达；分裂报告系统将报告分子拆分成片段与目标蛋白融合，蛋白相互作用时报告分子重新激活发光。

图b使用了两种荧光素酶：
火蝇荧光素酶（Fluc）
用于作为主要的报告酶，检测分割报告系统（Split Reporter System）或蛋白互补分析（PCA）的信号。当两个部分的报告蛋白因为目标蛋白相互作用而重组时，会激活Fluc，从而在加入底物d-luciferin后产生光信号，反映出目标分子间的相互作用或基因表达的情况。
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海蛞蝓荧光素酶（Rluc）
被用作内参（normalization control），用于校正转染效率及其他实验条件的变异。Rluc的表达信号通过加入coelenterazine底物后检测，提供一个标准化的参考，使得Fluc信号的数据更为可靠和可比较。

文献链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4314955/#F2

3.细胞免疫和传染病成像

T细胞，由于其在细胞介导免疫中的关键作用，已经广泛使用BLI进行研究。在一些报道中，表达荧光素酶的T细胞被用来研究这些细胞的动力学和功能，以及它们的抗肿瘤活性和浸润肿瘤的能力。

图中表达extGluc和CAR的人T细胞在皮下肿瘤中蓄积。文献链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4314955/#F3

4.干细胞成像

干细胞领域的一个主要挑战是能够追踪这些细胞，定位它们的生态位并监测它们在体内的命运。这些目标可以通过神经、心脏、造血和间充质干细胞的BLI来实现，这些干细胞是细胞替代疗法、再生医学以及肿瘤治疗的重要工具。干细胞的主要特性之一是自我更新。最近，在小鼠身上移植的单个肌肉干细胞被证明能够增殖并产生肌肉纤维。BLI允许在体内监测这些肌肉细胞的动力学和行为。文献链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18806774/

5.神经性的应用

分泌途径是细胞将蛋白质纳入细胞膜并将蛋白质分泌到细胞外空间的能力的关键指标。这一途径在内质网（ER）受到胁迫时被破坏，内质网可由多种因素引起，如突变蛋白的表达和生理应激。在干扰分泌途径或诱导ER应力的诱导后，条件培养基中分泌的GLUC水平会显着降低。文献链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001457930700912X

实验中通过转染表达GLuc，并利用其底物共elenterazine (CTZ)激发产生光信号，来进行细胞内外荧光素酶活性的时空成像。

6.肿瘤相关成像

癌症的高复杂性，肿瘤细胞与周围组织的相互作用以及它们在整个生物体中的侵袭使肿瘤细胞的特定跟踪非常可取。 BLI已用于评估分子和细胞事件，导致宿主动物模型中植入后的恶性转化，肿瘤的生长和行为，最后跟踪癌症干细胞或转化的成年细胞。

(a) PCL-1探针。H2O2介导荧光素的释放，从而产生生物发光。（b-e）体内H2O2的BLI。将表达Fluc的小鼠注射PCL-1，然后注射不同剂量的H2O2。在注射H2O2后几分钟，观察到以总光子通量表示的BLI呈剂量依赖性增加（b-c）。注射抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸（NAC）导致BLI信号降低，进一步证实了PCL-1作为体内H2O2报告者的特异性（d-e）。文献链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4314955/#F4

三、论生物发光成像，D - 荧光素钾盐为不二之选的卓越产品

生物发光成像（BLI）在细胞和小动物模型生物过程研究中极具价值，可助力药物研发及动物模型中治疗方案的功能评估。随着基因组研究的进步，BLI 需不断发展以辅助基因组研究并在生物学、病理学和药理学等领域提供更多信息。新型成像设备和荧光素酶的开发能进一步提升 BLI 的实用性。但 BLI 技术转化至临床存在光穿透深度有限、荧光素潜在毒性等挑战。
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在此，特别推荐我们的 D - 荧光素钾盐，作为 BLI 中常用的关键底物，它能有效参与生物发光反应。我们的 D - 荧光素盐具有高纯度、稳定性强的特点，能确保生物发光成像实验的准确性和可靠性，为您的科研工作提供有力支持。无论是基础的生物过程研究，还是药物研发相关的实验，D - 荧光素盐都是您的优质选择，助力您在生物发光成像领域取得更出色的成果。