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凝胶电泳

凝胶电泳是生命科学研究中常规用于分离和分析带电大分子的核心分子技术。通过对凝胶介质施加电场,可以根据其大小、电荷或构象分离和纯化蛋白质和核酸片段等大分子。虽然通常作为 PCR 后的分析程序进行,但凝胶电泳方法也为印迹、克隆、DNA 测序和其他各种下游应用的制备取得了很大成功。

 

凝胶电泳原理

如前所述,凝胶电泳涉及使用电场根据大小、电荷或构象分离蛋白质和核酸片段。该场通常在电泳室(例如硬塑料罐)中产生,通常称为凝胶盒(图 1)。

图1. 凝胶电泳工作流程说明

凝胶盒是一种装有缓冲液的容器,一端为阴极(负极),另一端为阳极(正极),外接电源。凝胶作为抗对流和筛分介质,首先浸入缓冲液中,其孔靠近阳极。然后使用移液器将样品装入凝胶孔中。当外部电源打开时,向缓冲液施加电场,使带电分子通过凝胶向相反的终端(即,向阳极)移动。根据分子的大小,它将以不同的速率和距离穿过基质。较小的分子将比较大的分子更快地通过凝胶基质迁移,最短的分子移动得最远。

 

凝胶电泳的类型

两种最常见的凝胶电泳方法包括用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳和用于分离蛋白质和 500 个碱基对或更少的核酸片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。下表总结了琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳之间的主要区别。

表1. 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳之间的主要区别总结

电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
凝胶类型 琼脂糖 聚丙烯酰胺
凝胶成分 琼脂糖是从海藻中提取的多糖。凝胶含有长链相互连接的糖,形成网状结构。 聚丙烯酰胺是通过腈水合酶消化丙烯腈制成的合成树脂。凝胶是通过丙烯酰胺和双丙烯酰胺化学交联产生分子筛而制成的。
凝胶浇注法 凝胶在冷却时凝固。琼脂糖粉在缓冲液中混合并微波处理。然后将混合物倒入凝胶框架中并使其凝固。 一旦发生交联,凝胶就会通过化学反应凝固。
孔隙特性 浓度决定孔径。随着浓度的增加,孔径变小。 (典型浓度为 0.5-2%)。 丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例决定了孔径。 (典型浓度为6-15%)
凝胶运行方向 凝胶水平运行。 凝胶垂直运行。
应用 分离长度为 50-20,000 个碱基对的核酸片段。 分离长度为 5-500 个碱基对的蛋白质和核酸片段(例如,寡核苷酸、miRNA、tRNA 等)。
优点
  • 无毒凝胶介质
  • 凝胶易于浇铸和快速凝固
  • 适用于分离大 DNA 分子,如 PCR 产物和双链 DNA
  • 可以通过熔化凝胶、用酶琼脂糖消化或用离液盐处理从凝胶中回收样品
  • 稳定的化学交联凝胶
  • 孔径大小均匀
  • 分辨率高,条带清晰
  • 适用于分离低分子量片段,如单链 DNA
缺点
  • 琼脂糖很贵
  • 分辨率较低,条带模糊
  • 低分子量碎片分离不佳
  • 孔径不均匀
  • 有毒单体(即丙烯酰胺是一种有效的神经毒素)
  • 凝胶制备繁琐且容易泄漏
  • 每个实验都需要新的凝胶

 

分离后的 DNA 样本检测

通过电泳分离后,可以使用几种不同的方法观察核酸片段。最广为人知的使核酸片段可视化的方法是用溴化乙锭 (EtBr) 染色。然而,因为 EtBr 具有高度致癌性、细胞毒性和致突变性。它对环境有害,必须小心处理和处置。 EtBr 的更安全替代品包括新型凝胶染色剂,例如 Gelite Safe *10,000X Water Solution*、Gelite Safe *10,000X DMSO Solution*、Helixyte Green 和 Helixyte Gold,以及凝胶染色试剂盒,例如 Gelite Green Nucleic酸性凝胶染色试剂盒和 Gelite Orange 核酸凝胶染色试剂盒。这些凝胶染色剂和试剂盒不仅比 EtBr 的致突变性更小,而且 Gelite Safe、Helixyte Green、Helixyte Gold 和 Gelite 核酸染色试剂盒可以检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸,灵敏度更高,背景更少干涉。



Gel Stain Comparison
图2. 使用 Gelite Safe、EtBr 和 SYBR® Safe 在 TBE 缓冲液中的 1% 琼脂糖凝胶中检测 DNA 的比较

表2.用于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳的核酸染色试剂

产品名称 Ex (nm) 滤波片 规格 货号
Cyber Green 核酸凝胶染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17590
Cyber Green 核酸凝胶染料 [相当于 SYBR® Green] *10,000X DMSO 溶液* 254 mn Long path green filter 100 µL 17604
Cyber Orange 核酸凝胶染料 10000X DMSO 254 mn Long path green filter 1 mL 17595
Gelite 绿色核酸凝胶染色试剂盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17589
Gelite 橙色核酸凝胶染色试剂盒 254 nm or 300 nm Long path green filter 1 Kit 17594
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17700
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17701
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17702
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17703
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 100 µL 17704
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 500 µL 17705
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 1 mL 17706
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 254 nm, 300 nm or 520 nm Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters 10 mL 17707

 

分离后的蛋白质样品检测

对于蛋白质,可以使用产生颜色的化学反应或染料结合的方法来实现可视化。确定使用哪种方法在很大程度上取决于实验条件和预期的下游应用。检测凝胶中蛋白质的常用策略包括考马斯染料染色、银染色、锌染色和荧光染料染色。虽然考马斯染料和银染色方法在总蛋白质分析中仍然很受欢迎,但荧光染料染色方法提供了更高的灵敏度和线性动态范围。

表3.凝胶蛋白染色方法总结

染料类型 灵敏度范围 操作时间 检测方法 兼容的下游应用 特点
考马斯染料 5 - 25 ng 10 - 135 minutes
  • 比色法
  • 质谱
  • 测序
  • 蛋白质印迹
  • 快速简便的染色方案
  • 可逆
银染 0.25 - 0.5 ng 30 - 120 minutes
  • 比色法
  • 质谱
  • 最稳定和灵敏的比色法
  • 方案需要几个步骤
  • 染色剂使用戊二醛或甲醛作为增强剂,这会导致蛋白质在凝胶基质中交联
锌染 0.25 - 0.5 ng 15 minutes
  • 比色法
  • 质谱
  • 蛋白质印迹
  • 程序染色聚丙烯酰胺凝胶而不是蛋白质
  • 无需固定步骤 染料可以轻松去除
荧光染料 0.25 - 0.5 ng 60 minutes
  • 紫外/蓝/绿光透照仪
  • 凝胶系统
  • 激光拍照
  • 质谱
  • 蛋白质印迹
  • 宽线性动态范围和灵敏
  • 与脱色和蛋白质回收方法兼容
  • 常用于一维和二维应用

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