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AF NHS酯系列产品实验方案(通用版)

English title: experimental scheme of AF NHS(General Edition)

 

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  • AF NHS酯系列产品实验方案(通用版)

 

重要免责声明:以下是使用AF NHS酯系列产品标记蛋白/抗体示例方案。 该方案仅提供指南,实际请根据您的实验进行调整。该标记方案不适用于含有BSA、明胶、游离氨基酸或铵盐的抗体或蛋白质。  


 

一、实验准备

蛋白选择

蛋白:  IgG - Immunoglobulin G
分子量(kDa):150

材料准备

  1. 1.AF  琥珀酰亚胺酯
    2.IgG
    3.1 M 碳酸氢钠缓冲液
    4.PBS,pH:7.2-7.4
    5.1 M NaOH 或 1 M HCl
    6.DMSO
    7.Sephadex® G-25、Bio-Gel®P-6 DG或其他层析柱
    8.Spin Column旋转离心柱

1 M 碳酸氢钠配制

碳酸氢钠分子量为84.007 g / mol

所需体积:50ul
碳酸氢钠质量:4.2mg

配制1 M 碳酸氢钠的步骤:

1.向合适的容器中添加4.2 mg NaHCO3
2.然后添加蒸馏水直至溶液体积到达50ul
3.缓冲液的pH值应保持在8.5-9.5之间
4.如果pH值低于8.5,请通过添加1 M NaOH进行pH调整
5.如果pH值高于9.5,请通过添加1 M HCl进行pH调整

 

二、实验步骤

1.准备PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)和1 M碳酸氢钠溶液。
2.
2.1检查IgG溶液中是否有杂质
   A:检查蛋白质是否含有防腐剂,例如叠氮化钠或小分子稳定剂
   B:检查蛋白质是否溶解在TRIS或甘氨酸缓冲液中
没有则不含杂质
2.2其它步骤
     如果没有其它步骤,请继续第三步

3.
   3.1准备IgG储备溶液
       蛋白质的形式:悬浮液
   3.2悬浮液中制备IgG溶液
      A:初始蛋白质浓度:10 mg / mL
      B:所需蛋白浓度:10 mg / mL
      C:所需体积100ul
     D:将100μL初始的(10 mg / mL)蛋白质溶液转移到合适的容器中。然后添加0.00μLPBS缓冲液(pH 7.2-7.4),使体积为100μL。 蛋白质标记溶液的浓度为10 mg / mL,等于0.0667 mM

4.准备10 mg / mL AF  琥珀酰亚胺酯标记溶液
        在合适的容器中,将1 mg AF  琥珀酰亚胺酯溶解在100μLDMSO中,制成浓度为10 mg / mL的标记溶液

5.
    5.1检查您IgG溶液的pH
         蛋白质溶液的pH值是否在8.5-9.5之间(如果不在,请进行步骤5.2)
    5.2其它步骤
         通过添加1 M碳酸氢钠(pH 8.5-9.5)来调节蛋白质溶液的pH,其体积应等于抗体溶液的5%。

6.
    6.1确定蛋白质与蛋白质的标记比例(AF   琥珀酰亚胺酯与IgG的比例)
         选择所需的AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的比例。 10:1为结果,可选择的比例有5:1、10:1 15:1或20:1(IgG的标记单位为:mg)
    6.2在进行缀合反应之前,请对以下各项进行检查:
          A:确保DMSO的数量占总反应量的不到10%
          B:在开始反应之前,请确保已准备好AF 琥珀酰亚胺酯标记溶液,蛋白质溶液和缓冲液。

7.进行AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的缀合反应
     7.1使用10:1的摩尔比标记1 mg的蛋白质,将(根据实验调整)μL AF 琥珀酰亚胺酯溶液混合到装有100μL蛋白质溶液的小瓶中,并混合均匀
     7.2 在室温下(37°C)连续旋转或摇动您的反应混合物1小时。

8.使用1 mL旋转柱纯化蛋白缀合物
    8.1准备Sephadex®G-25,BioGel®P-6 DG或其他脱盐柱;
注意:1 mL离心柱适合纯化100μL缀合物
    8.2排干溶液(顶部排出),并使用约4 mL PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)进行缓冲液更换;
    8.3将色谱柱在2000X旋转2分钟,然后将15 mL离心管换成全新的;
    8.4将反应混合物(直接来自步骤7)从脱盐柱顶部加入;
    8.5加入10μLPBS缓冲液(pH 7.2-7.4);
    8.6 2000X离心柱5分钟;
    8.7收集洗脱液并使用分光光度计(例如NanoDrop)检测浓度。

9.使用我们的DOL计算器表征蛋白质缀合物
Degree of Labeling (DOL) Calculator

10.结果与建议
   10.1如果您对蛋白质缀合物的DOL不满意,则可以返回到步骤6并尝试使用不同的标记率;
   10.2如果您对蛋白质缀合物的DOL感到满意,请用PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)和等分试样稀释以多次使用;
   10.3如果您以后要使用蛋白质缀合物,请按照存储规范进行存储。

 

三、其他信息

1.  1 M NaOH配方
1.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水;
1.2在混合的同时向溶液中缓慢加入100 mg NaOH;
1.3加入蒸馏水直至体积为2.5 mL;
1.4将溶液在室温下储存在塑料容器中。*这是放热过程,应选择适当的防护措施*

2.  1M HCl配方
2.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水;
2.2边搅拌边向溶液中缓慢加入91.15 mg盐酸(HCl);
2.3向溶液中加入500μL蒸馏水,体积为2.5 mL;
2.4在室温下将溶液储存在塑料容器中。

3.储存条件
3.1AF 琥珀酰亚胺酯应储存在<-15°C下,干燥并避光;
3.2AF 琥珀酰亚胺酯DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存少于两周;
3.3蛋白质缀合物应在载体蛋白(例如0.1%牛血清白蛋白)存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度存储;
3.4缀合物溶液可以在4°C下保存2个月,如果在2 mM叠氮化钠存在下避光保存,则不会发生明显变化;
3.5对于长期保存,必须将蛋白质缀合物冻干或分成单份并在 ≤–60°C避光保存。