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重要免责声明：以下是使用Mag-Fura-2,AM活细胞标记方案。 该方案仅提供指南，实际请根据您的实验进行调整。
一、实验准备
仪器选择
仪器：荧光酶标仪
激发：340，380
发射：510
Cutoff：475
孔板：纯黑色
仪器：荧光显微镜
激发：Fura 2滤波片组
发射：Fura 2滤波片组
孔板：黑色透明底板
材料准备
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注：该说明书包括非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 和有机阴离子转运抑制剂丙磺舒。两种试剂都不是必需的，但推荐使用
- 必需品：
- 1.Mag-Fura-2,AM
2.HHBS(Hanks+Hepes)缓冲液或您自备的缓冲液
3.100% DMSO
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- 非必需品：
1. 10% Pluronic F-127
2. 25mM丙磺舒
二、实验步骤
1.准备HHBS缓冲液、10%Pluronic F-127溶液和25mM丙磺舒溶液。
2.在高质量无水DMSO中制备2mM-5mM Mag-Fura-2 AM 储备溶液
A:Mag-Fura-2 AM用量：1mg
B:所需浓度：2mM
C:在合适的容器中将 1 mg Mag-Fura-2, AM *Cell-permeant* 与 691.98 µL 无水 DMSO 混合。
3.在含有10uM Mag-Fura-2 AM,0.08%Pluronic F-127和2mM丙磺舒的HHBS中制备2X工作溶液
A:Mag-Fura-2 AM的最终孔内浓度：5uM
B:Pluronic F-127的最终孔内浓度：0.04%
C:丙磺舒最终孔内浓度：1mM
D:在合适的容器中混合16uL Mag-Fura-2 AM,25.6uL 10%Pluronic F-127和 256uL 25mM 丙磺舒，接下来添加HHBS或您自备的缓冲液直至体积为3.2ml。
注意1：对于大多数细胞系，我们建议Mag-Fura-2 AM的最终浓度为2-5uM
注意2：推荐的Pluronic F-127的最终孔内浓度为0.02%-0.04%
注意3：推荐的丙磺舒孔内最终浓度为1-2.5mM。
4.将100uL的染料工作溶液添加到已经含有100uL培养基的孔中。
此步骤将染料工作溶液的浓度从2X稀释到1X，并将每种成分的最终浓度调整为以下：5uM Mag-Fura-2 AM，0.04% Pluronic F-127，1mM丙磺舒。
5.孵育添加好染料的培养基
A:在细胞培养箱中孵育培养基30-60min。
B:在室温孵育细胞30min。
6.向HHBS缓冲液或您自备的缓冲液中加入0.1mM丙磺舒
在合适的容器中加入160uL的25mM丙磺舒。然后添加HHBS或您自备的缓冲液，直至体积为4mL。
7.更换染料工作溶液（使用含有1.0mM丙磺舒的HHBS或含丙磺舒的其他缓冲溶液）
A:首先，从每孔取出200ul 的染料工作溶液和培养基。
B:向那些相同的孔中加入200ul的含有1.0mM的HHBS(或您自备的缓冲液)。
8.进行实验检测
A:为您的样品添加所需处理
B:在Ex/Em=336/503nm处检测荧光。
三、其他信息
1. 1 M NaOH配方
1.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水；
1.2在混合的同时向溶液中缓慢加入100 mg NaOH；
1.3加入蒸馏水直至体积为2.5 mL；
1.4将溶液在室温下储存在塑料容器中。*这是放热过程，应选择适当的防护措施*
2. 10%Pluronic F-127配方
2.1将1g Pluronic F-127(Cat#20050)溶解在10mL蒸馏水中，制成10%（w/v）的储备溶液。
2.2在40-50oC的温度下加热10%Pluronic F-127 储备溶液约30分钟。
2.3储存多余的10%Pluronic F-127。
3. 25mM丙磺舒配方
3.1在合适的容器中，将1瓶（72mg）丙磺舒（Cat#20060）溶解在0.3ml的1M NaOH中。
3.2添加HHBS或您自备的缓冲液，直至体积为10ml。
2.3根据储存规范，分装并储存未使用的25mM丙磺舒溶液。
4.储存条件
4.1建议在同一天制备和使用 Mag-Fura-2, AM *Cell-permeant* 原液。但是，如果需要提前制备储备液，我们建议将 Mag-Fura-2, AM *Cell-permeant* 储备液等分保存在 -20°C 的密封小瓶中，干燥并避光。在这些条件下，AM 酯应能稳定 3 个月。
4.2 10% Pluronic F-127 原液必须在室温下（请勿冷冻）保存长达 6 个月。
4.3 20 mM 丙磺舒 *在水溶液中稳定* 可在 -20°C 下避光保存长达 6 个月。避免重复的冻融循环。
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