重要免责声明:以下是使用ATTO 酸系列产品标记蛋白/抗体示例方案。 该方案仅提供指南,实际请根据您的实验进行调整。该标记方案不适用于含有BSA、明胶、游离氨基酸或铵盐的抗体或蛋白质。
一、实验准备
蛋白选择
蛋白: IgG - Immunoglobulin G 分子量(kDa):150
材料准备
- 1.ATTO 酸
2.IgG 3.1 M 碳酸氢钠缓冲液 4.PBS,pH:7.2-7.4 5.1 M NaOH 或 1 M HCl 6.DMSO 7.Sephadex® G-25、Bio-Gel®P-6 DG或其他层析柱 8.Spin Column旋转离心柱
1 M 碳酸氢钠配制
(碳酸氢钠分子量为84.007 g / mol)
所需体积:50ul 碳酸氢钠质量:4.2mg
配制1 M 碳酸氢钠的步骤:
1.向合适的容器中添加4.2 mg NaHCO3 2.然后添加蒸馏水直至溶液体积到达50ul 3.缓冲液的pH值应保持在8.5-9.5之间 4.如果pH值低于8.5,请通过添加1 M NaOH进行pH调整 5.如果pH值高于9.5,请通过添加1 M HCl进行pH调整
二、实验步骤
1.准备PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)和1 M碳酸氢钠溶液。 2. 2.1检查IgG溶液中是否有杂质 A:检查蛋白质是否含有防腐剂,例如叠氮化钠或小分子稳定剂 B:检查蛋白质是否溶解在TRIS或甘氨酸缓冲液中 (没有则不含杂质) 2.2其它步骤 如果没有其它步骤,请继续第三步
3. 3.1准备IgG储备溶液 蛋白质的形式:悬浮液 3.2悬浮液中制备IgG溶液 A:初始蛋白质浓度:10 mg / mL B:所需蛋白浓度:10 mg / mL C:所需体积100ul D:将100μL初始的(10 mg / mL)蛋白质溶液转移到合适的容器中。然后添加0.00μLPBS缓冲液(pH 7.2-7.4),使体积为100μL。 蛋白质标记溶液的浓度为10 mg / mL,等于0.0667 mM。
4.准备10 mg / mL AF 琥珀酰亚胺酯标记溶液 在合适的容器中,将1 mg AF 琥珀酰亚胺酯溶解在100μLDMSO中,制成浓度为10 mg / mL的标记溶液
5. 5.1检查您IgG溶液的pH 蛋白质溶液的pH值是否在8.5-9.5之间(如果不在,请进行步骤5.2) 5.2其它步骤 通过添加1 M碳酸氢钠(pH 8.5-9.5)来调节蛋白质溶液的pH,其体积应等于抗体溶液的5%。
6. 6.1确定蛋白质与蛋白质的标记比例(AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的比例) 选择所需的AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的比例。 10:1为结果,可选择的比例有5:1、10:1 15:1或20:1(IgG的标记单位为:mg) 6.2在进行缀合反应之前,请对以下各项进行检查: A:确保DMSO的数量占总反应量的不到10% B:在开始反应之前,请确保已准备好AF 琥珀酰亚胺酯标记溶液,蛋白质溶液和缓冲液。
7.进行AF 琥珀酰亚胺酯与IgG的缀合反应 7.1使用10:1的摩尔比标记1 mg的蛋白质,将(根据实验调整)μL AF 琥珀酰亚胺酯溶液混合到装有100μL蛋白质溶液的小瓶中,并混合均匀 7.2 在室温下(37°C)连续旋转或摇动您的反应混合物1小时。
8.使用1 mL旋转柱纯化蛋白缀合物 8.1准备Sephadex®G-25,BioGel®P-6 DG或其他脱盐柱; 注意:1 mL离心柱适合纯化100μL缀合物 8.2排干溶液(顶部排出),并使用约4 mL PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)进行缓冲液更换; 8.3将色谱柱在2000X旋转2分钟,然后将15 mL离心管换成全新的; 8.4将反应混合物(直接来自步骤7)从脱盐柱顶部加入; 8.5加入10μLPBS缓冲液(pH 7.2-7.4); 8.6 2000X离心柱5分钟; 8.7收集洗脱液并使用分光光度计(例如NanoDrop)检测浓度。
9.使用我们的DOL计算器表征蛋白质缀合物 Degree of Labeling (DOL) Calculator
10.结果与建议 10.1如果您对蛋白质缀合物的DOL不满意,则可以返回到步骤6并尝试使用不同的标记率; 10.2如果您对蛋白质缀合物的DOL感到满意,请用PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)和等分试样稀释以多次使用; 10.3如果您以后要使用蛋白质缀合物,请按照存储规范进行存储。
三、其他信息
1. 1 M NaOH配方 1.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水; 1.2在混合的同时向溶液中缓慢加入100 mg NaOH; 1.3加入蒸馏水直至体积为2.5 mL; 1.4将溶液在室温下储存在塑料容器中。*这是放热过程,应选择适当的防护措施*
2. 1M HCl配方 2.1在合适的容器中准备2 mL蒸馏水; 2.2边搅拌边向溶液中缓慢加入91.15 mg盐酸(HCl); 2.3向溶液中加入500μL蒸馏水,体积为2.5 mL; 2.4在室温下将溶液储存在塑料容器中。
3.储存条件 3.1AF 琥珀酰亚胺酯应储存在<-15°C下,干燥并避光; 3.2AF 琥珀酰亚胺酯DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存少于两周; 3.3蛋白质缀合物应在载体蛋白(例如0.1%牛血清白蛋白)存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度存储; 3.4缀合物溶液可以在4°C下保存2个月,如果在2 mM叠氮化钠存在下避光保存,则不会发生明显变化; 3.5对于长期保存,必须将蛋白质缀合物冻干或分成单份并在 ≤–60°C避光保存。
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