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染料蛋白标记是一种非常重要的实验，在实验之前，我们需要预估购买的染料是否足够标记蛋白？
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一、以iFluor 488NHS酯（1mg）为例的蛋白质量计算
1.需要的信息：
a.染料的分子量：945.07
b.蛋白的分子量：200kDa
c.染料蛋白比例，例如：10：1（染料十倍过量）
2.计算1mg染料可以标记的蛋白质量：
a.计算染料的摩尔数：1/945.07=1.058 μmol
b.计算蛋白的摩尔数：
由于我们按照10：1来计算，所以蛋白摩尔数=染料摩尔数/10=0.1058 μmol
c.计算蛋白的质量：0.1058 μmol×200,000 g/mol=21.16 mg
3.结论：
1 mg iFluor 488 NHS酯 在 10:1 染料:蛋白摩尔比 条件下，理论上可标记 约 21.2 mg 的 200 kDa 蛋白。
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二、实验注意事项
1.染料抗体的预处理：
①染料溶解
a.使用无水DMSO配制高浓度母液（如10 mM），避免反复冻融。
b.避光操作，防止光漂白（尤其光敏感染料）
②抗体纯化
a.透析或脱盐柱去除干扰物质（如Tris、铵盐、NaN₃）
b.抗体浓度建议≥1 mg/mL，低浓度可能导致标记效率下降。浓度过低建议浓缩。
2.反应条件优化：
①pH控制：反应缓冲液pH 8.5±0.5（如碳酸盐或磷酸盐缓冲液）。
②摩尔比筛选：通过预实验测试不同比例（如5:1、10:1、20:1），平衡标记效率与抗体活性。
③反应时间：室温避光反应30–60分钟，过长可能增加非特异性结合。
3.纯化与质量控制：
①纯化方法：使用凝胶过滤层析（如Sephadex G-25）去除游离染料。
②超滤浓缩或冻干保存标记后抗体。
③标记度测定：通过吸光度计算标记度（DOS），计算工具
三、常见问题及解决方案
| 问题 |
可能原因 |
解决方案 |
| 标记效率低 |
抗体浓度不足或含干扰物质 |
提高抗体浓度，透析去除杂质 |
| 抗体聚集 |
过度标记或缓冲液不兼容 |
优化摩尔比，更换缓冲液（如PBS） |
| 荧光信号弱 |
标记度过低或染料降解 |
增加染料比例，使用新鲜配制染料 |
| 非特异性背景高 |
游离染料未完全去除 |
延长纯化时间，增加洗涤步骤 |
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iFluor, AlexaFluor, 百萤生物, AAT Bioquest
