如何使用Fura-2AM定量胞内的钙离子浓度？

摘要

钙成像技术（Calcium Imaging）因其高时空分辨率成为研究钙信号的主流方法。其中，Fura-2 AM 作为一种比率型荧光探针，通过双波长激发下的荧光比值变化实现对细胞内钙浓度的定量测量，有效克服了染料分布不均、细胞厚度差异等干扰因素。本文基于 Barreto-Chang 与 Dolmetsch (2009) 发表于 Journal of Visualized Experiments 的经典实验流程，系统介绍使用 Fura-2 AM 进行钙成像的实验设计、操作步骤、数据校准与分析方法，希望该内容可以帮助大家准确实现钙信号的定量化研究。（文献中含有视频可供查看。）

一、Fura-2AM的工作原理与优势

Fura-2 AM 是 Fura-2 的乙酰甲酯衍生物，具细胞膜通透性。进入细胞后，被胞内酯酶水解为 Fura-2 游离酸，无法逸出细胞膜，从而实现对胞内钙离子的特异性响应。Fura-2 的最大特点在于其激发光谱随钙离子结合发生位移：无钙时最大激发波长为 380 nm，结合钙离子后最大激发波长移至 340 nm，发射光峰值始终稳定在 505 nm 附近。

图1. 该图含有0至39微摩尔游离钙离子的溶液中Fura-2的荧光激发光谱

比率法（Ratiometric）计算（R = F₃₄₀ / F₃₈₀）具有三大优势：

     ①抵消浓度差异：比值与染料浓度无关，避免因细胞负载效率不同导致的信号偏差；

     ②减少光学伪影：消除光路长度、光照强度波动、细胞厚度不均等因素的影响；

     ③直接定量钙浓度：通过标准公式将比率值 R 转换为准确的细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]ᵢ）。

二、文献实验流程

1.细胞准备与染料加载

①基底处理：细胞需培养在 #1 玻璃盖玻片上，并使用多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）或层粘连蛋白（Laminin）进行包被，以增强细胞粘附，防止成像过程中细胞移动或脱落。

②染料加载：

     a.将 Fura-2 AM 粉末用无水 DMSO（建议使用氮气密封包装以防止吸水）配制成 1 mM 储存液。分装后于 -20°C 干燥避光保存，可稳定数月。

     b.实验时，用不含酚红的培养基（酚红会增加背景荧光）将储存液稀释至工作浓度（1–4 μM）。对于皮层神经元，通常使用 1 μM 工作液。

     c.将细胞在37°C避光条件下孵育 30 分钟。

     d.用预温的新鲜培养基洗涤细胞 1-2 次，以去除胞外未进入细胞的染料，然后在新鲜培养基中避光恢复 15-30 分钟，确保胞内酯酶将 AM 酯充分水解。

2.成像系统配置

一个典型的比率钙成像系统包括：

①倒置荧光显微镜（如 Nikon Eclipse TE2000-U）

②氙灯光源（如 Sutter Instruments）

③高速激发滤光轮：配备 340 nm 和 380 nm 窄带滤光片（如 Ludl）

④高数值孔径物镜（如 Nikon CFI Plan Fluor 40× Oil, NA 1.3）

⑤冷却CCD相机（如 Hamamatsu Orca-II）

3.图像采集与比率计算

①背景扣除：在无细胞区域选取多个 ROI，测量其在 340 nm 和 380 nm 下的平均荧光强度（F_bkgd340, F_bkgd380），并在后续计算中从每个像素点的荧光值中减去。

②采集双波长图像：对同一视野，依次快速采集 340 nm 和 380 nm 激发下的图像（F₃₄₀, F₃₈₀）。曝光时间通常设置在 50-200 ms，以避免光毒性和染料漂白。

③计算比率图像：软件根据公式 R = (F₃₄₀ - F_bkgd340) / (F₃₈₀ - F_bkgd380) 生成比率图像（Ratio Image）。

三、从比率（R）到钙浓度（[Ca²⁺]ᵢ）的定量转换

1.计算公式：

将比率值 R 转换为绝对钙浓度需使用 Grynkiewicz 公式：

​

其中：

Kd​：Fura-2 与 Ca²⁺ 的解离常数，约 224 nM（生理条件下，不同实验室略有差异）。

$R$：实验测得的 340 nm/380 nm 荧光比率。

Rmin​：在零钙（Ca²⁺-free）条件下测得的比率。

Rmax​：在钙饱和（Saturating [Ca²⁺]）条件下测得的比率。

$\beta$：定义为 F₃₈₀,min / F₃₈₀,max，即 380 nm 激发下，零钙与钙饱和时的荧光强度比值。（注：我们的产品说明书中命名为Q，在该公式中β与Q意义相同） 

2.系统校准：

获取准确的 RminRmin​, RmaxRmax​, $\beta$ 值至关重要，校准方法分为两种：

①体内校准（In vivo Calibration）：精度高但技术难度大。需使用膜片钳技术向细胞内灌注已知浓度的钙缓冲液（如 10 mM BAPTA 用于 Rmin，10 mM CaCl₂ 用于 Rmax），同时进行成像测量。

②体外校准（In vitro Calibration）：操作简便，更为常用。在含有不同已知游离钙浓度（0 - 39 μM）的缓冲液中加入 Fura-2 游离酸（盐）（我们的货号是：21025/21026），在相同的显微镜设置下测量各溶液的 R 值，绘制标准曲线，进而拟合出 Rmin​, Rmax​, β和 有效 Kd。

四、数据分析与结果呈现

1.定义感兴趣区域（ROI）：在比率图像上圈定单个细胞胞体或特定亚细胞区域。

2.提取时间序列数据：软件可输出每个 ROI 在每一个时间点的平均比率值 R(t)。

3.转换为钙浓度：将 R(t) 代入 Grynkiewicz 公式，计算得到每一时刻的 [Ca²⁺]ᵢ(t)。

4.绘图与统计分析：

①绘制 钙瞬变曲线（[Ca²⁺]ᵢ - Time Trace），显示细胞对刺激（如高钾、药物）的反应。

②对多次重复实验的曲线进行对齐、平均，计算平均响应峰值、上升时间、衰减时间常数等参数。

③使用统计方法（如 t-test, ANOVA）比较不同实验组间的差异。

文献支持：Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM - PMC