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实时PCR(qPCR)

实时聚合酶链反应,也称为定量PCR(qPCR),通常用于分子生物学中检测和定量特定的寡核苷酸序列或分析基因表达水平的变化。通过在单个步骤中结合DNA扩增和检测过程,qPCR使研究人员能够实时检测扩增子的相对或绝对浓度,因为它是在整个PCR循环过程中产生的。除了基因表达研究外,qPCR在广泛的分子生物学应用中也有应用,包括基因分型、药物靶点验证、生物标记物发现、病原体检测和RNA干扰检测。此外,只要对基本方案稍作修改并添加逆转录酶,qPCR就可以用于检测mRNA水平,以检测和诊断病毒感染。

 

qPCR的基本原理

在qPCR中,使用与常规PCR相同的扩增程序。作为模板的靶DNA片段与扩增反应所必需的其他组分(例如,耐热DNA聚合酶、正向和反向引物、脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTPs)和反应缓冲液)结合在一根试管中。将准备好的管子放入热循环器的仪器中。热循环器是一种实验室设备,通常具有带有孔的热块,在孔中插入装有PCR反应混合物的管。然后,对反应物进行一系列时间和温度相关的步骤——变性、引物退火和延伸(见表1)——这一系列步骤重复25至30次,导致DNA模板的指数放大。

图1 与传统PCR一样,qPCR采用相同的三步扩增程序——变性、退火和延伸


表1 qPCR循环反应基本步骤概述

步骤 温度 时间 过程
变性 95°C ∼20 to 30 秒 双链DNA(dsDNA)模板加热至高温。这会破坏互补碱基对之间的氢键,导致双链DNA分离成单链DNA(ssDNA)。
  • 注:如果模板GC含量相对较高,则所需的变性时间可能会增加。
引物退火 48 to 72°C ∼20 to 40 秒 变性后,反应温度降低至∼48至72°C。这促进正向和反向引物与每个单链DNA模板的结合,以及随后DNA聚合酶与引物-模板杂交的结合。
  • 注:为确保最佳效率和特异性,确定退火步骤的适当温度至关重要。典型的退火温度比引物的熔化温度(Tm)低约5°C。
延伸 68 to 72°C ∼1 to 2 分钟 退火后,反应温度升高至∼68至72°C。这使DNA聚合酶能够延伸引物,在5'至3'方向合成与单链DNA模板互补的新DNA链。

qPCR和常规PCR之间的主要区别有两个方面。首先,qPCR提供了整合各种荧光检测,例如使用DNA插入染料或序列特异性荧光探针,以检测每个PCR周期后的扩增子浓度。荧光在整个PCR过程中都受到监控,扩增过程中产生的荧光量与产生的扩增DNA量成正比。其次,qPCR需要配备光学检测模块的热循环仪来检测产生的荧光信号。通过绘制荧光强度与周期数的关系图,qPCR仪器可以生成称为扩增图的曲线,表示整个PCR运行期间扩增子的累积。

qPCR荧光检测

在qPCR中,通常采用两种荧光检测策略来测量扩增子浓度,即基于染料的分析和基于探针的分析。

染料分析

图2 使用Helixyte 绿色(货号17591)的qPCR检测。

 

在基于染料的qPCR分析中,DNA插入荧光团,如 Helixyte Green在PCR过程中,绿色分子特异性地结合到双链DNA的小凹槽,以检测DNA扩增。这些染料单独的时候仅有微弱的背景荧光,但与双链DNA结合后荧光强度显著增强。随着扩增子浓度随着每个连续扩增周期的增加而增加,染料的荧光强度也随之增加,其程度与每个PCR周期中存在的双链DNA量成正比。这种类型的qPCR反应的设置简单方便。所有必要的成分,包括两个序列特异性引物、一个DNA模板和DNA结合染料,都混合在一个反应管中。这允许同时进行PCR产物的扩增和检测,并且无需任何PCR后续操作。

Helixyte qPCR
图3 使用Helixyte进行以GAPDH为靶点、输入100 ng–0.00001 ng cDNA的PCR定量检测

 

与微阵列相比,基于染料的qPCR在检测表达水平的适度变化方面更为灵敏,因此非常适合研究小的基因亚群。尽管双链DNA结合染料为qPCR提供了最方便和最经济的选择,但插入的检测的主要缺点是它不是序列特异性的。任何由非靶点和非模板扩增(NTC)产生的双链DNA都将被观察到,从而导致定量不太准确。为了检查引物二聚体伪影并确保扩增特异性,在扩增后进行熔融曲线分析。

表2 用于qPCR的双链DNA结合染料

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Cyber Green 20X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 5x1 mL 17591
Cyber Green 10000X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 1 mL 17592
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17597
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17598
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 50 µL 17608
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 1 mL 17609

 

探针分析

图4 基于探针的qPCR的图示

 

在基于探针的qPCR中,序列特异性荧光探针与引物结合使用来检测扩增产物。在包括杂交探针和分子信标在内的许多基于探针的qPCR化学中,最广泛使用的是与Taq DNA聚合酶相关的5'核酸酶分析。

5'核酸酶分析用荧光报告染料合成探针,如FAM、HEX、NED、TET、VIC、Cy3或Tide Fluor 共价连接到5'端的染料和淬灭剂染料(见下表4),如DABCYL、TAMRA、BXQ-1、BXQ-2或Tide Quencher与目标DNA序列互补的短寡核苷酸的3'端。当探针完好无损时,报告基因和淬灭剂保持紧密接触,发生FRET时,报告基因染料信号被淬灭。在PCR循环过程中,引物和探针都将退火至目标。当Taq DNA聚合酶与探针上游的引物结合并延伸时,任何与正确的靶序列结合的探针都会被水解,并释放含有报告染料的片段。现在可以检测荧光信号,产生的荧光信号量与产生的qPCR产品量成正比。

该方法不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且还允许使用不同报告染料组合的探针进行多路复用。这允许增加吞吐量,这意味着每个平板可以分析多个样品,因此,样品和试剂的使用量都会减少。

 

表3.  FRET 寡核苷酸的推荐 FRET 对

供体/受体 DABCYL TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5 TQ6 TQ7
EDANS +++ +++ + - - - - -
MCA +++ +++ + - - - - -
Tide Fluor 1 +++ +++ + - - - - -
FAM
FITC
+ + +++ + - - - -
Cy2®
Tide Fluor 2
+ + +++ + - - - -
HEX
JOE
TET
- - + +++ + - - -
Cy3®
TAMRA
Tide Fluor 3
- - + +++ + - - -
ROX
Texas Red®
- - - + +++ + - -
Tide Fluor 4 - - - + +++ + - -
Cy5®
Tide Fluor 5
- - - - + +++ + -
Cy5.5®
Tide Fluor 6
- - - - - + +++ +
Cy7®
Tide Fluor 7
- - - - - - + +++

 

实时PCR的ROX参考染料

6-ROXtra 荧光对照溶液

6-ROXtra - 光谱性质几乎与ROX相同-具有相当大的稳定性和水溶性。与ROX相比,6-ROXtra 提供了一种在qPCR中规范荧光报告信号的方便方法,无需修改仪器的默认分析参数。此外,6-ROXtra 可作为内部控制,通过以下方式提高qPCR数据的精度:

  1. 由于照明不均匀、移液不准确、样品效应、孔内或孔位起泡而导致的非PCR相关荧光信号变化的标准化
  2. 荧光波动的标准化(例如,机器噪声)
  3. 在多重qPCR分析中创建稳定的基线
ROX Comparitive Analysis
图5 PCR参考溶液(6-ROX,6-ROXtra)的稳定性比较 

 

表4 ROX参考染料

产品名称 应用 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
用于PCR反应的ROX 参比染料 50X荧光参比溶液 qPCR 578 604 5 mL 400
6-ROXtra,SE 25uM荧光法PCR检测参照液 qPCR 578 595 5 mL 398

 

表5 用于多重qPCR分析的ROX参照和报告基因染料

仪器 参照染料 报告基因染料1 报告基因染料2 报告基因染料3 报告基因染料4
ABI PRISM® 7700 ROX 6-FAM 6-TET - -
ABI PRISM® 7000 and 7900
Applied Biosystems® 7300
StepOnePlus
ROX 6-FAM 6-TET 6-HEX -
Applied Biosystems® 7500 ROX 6-FAM 6-TET 6-HEX Tide Fluor 3
iFluor 647
Alexa Fluor 647
Cy5

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