逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

English title: Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

Published on 2021-09-15

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种核心分子技术，旨在检测和定量总RNA或信使RNA（mRNA），具有高灵敏度和准确性。在这个标准PCR过程的改进版本中，作为初始模板的mRNA首先被反转录为互补DNA（cDNA），然后通过PCR扩增用于下游分析。相对于其他检测mRNA的技术，如Northern印迹分析、RNA酶保护分析或原位杂交，RT-PCR在检测任何基因的RNA转录物时，其相对丰度如何，都明显更为稳定。因此，RT-PCR被广泛用于定量研究基因表达、检测转录变体以及生成用于克隆和测序的cDNA模板。

逆转录聚合酶链反应原理

为了将PCR应用于RNA的研究，RNA样品必须首先使用酶逆转录酶进行逆转录过程以生成cDNA。这种RNA依赖性DNA聚合酶在逆转录引物、脱氧核苷酸（dNTPs:dATP、dTTP、dGTP和dCTP）和酶辅因子的协助下，催化从其各自的靶RNA序列合成cDNA。然后将得到的cDNA用作PCR扩增的模板，根据反转录和PCR的执行方式，该过程可分为一步RT-PCR或两步RT-PCR。

视频1 演示逆转录聚合酶链反应关键步骤的动画视频教程：（1）逆转录，（2）变性，（3）引物退火，（4）引物延伸

表1 用于PCR、实时PCR和逆转录PCR的脱氧核苷酸（dNTPs）

产品名称	溶剂	规格	货号
ReadiUse 即用型dNTP Mix溶液10mM	水	5 mL	17200

一步法RT-PCR

在一步RT-PCR中，反转录（即cDNA合成）和PCR在同一反应容器和缓冲液中进行。这种简单方便的单管设计在进行少量分析时效果良好，适用于高速、高通量应用。在一步RT-PCR中，需要序列特异性引物来指导cDNA的合成和扩增。由于特定引物比随机引物更容易在更高的反应温度下退火，因此在使用这种方法时，好利用具有高热稳定性的逆转录酶。

虽然一步RT-PCR方法有几个优点，但也有一些需要注意的地方。由于反转录和PCR都发生在同一试管中，因此不能单独优化反应条件，这可能会在不同程度上影响产率或反应效率。此外，由于所有合成的cDNA在随后的PCR步骤中被消耗，因此需要额外的原始RNA样本小份以重复反应或评估其他基因的表达。

图1 一步RT-PCR步骤

一步法RT-PCR的优缺点及应用

一步法RT-PCR
RT引物	基因特异性引物
优点	快速设置和少的样品处理单闭管反应了逆转录和PCR之间污染的可能性更少的移液操作将潜在误差降至低易于处理多个样本，用于重复测试或高通量筛选
缺点	必须重复或保存RNA小份，并执行新的RT以分析新的靶点或重复扩增反应条件不是佳效率，因此影响定量引物二聚体是一个更大的潜在问题由于反应条件是两个联合反应之间的折衷，因此比两步反应更不敏感每个样本检测较少的目标
应用	使用多个RNA样本仅扩增少数目标高通量应用重复进行分析

两步法RT-PCR

在两步RT-PCR中，逆转录和PCR在具有不同缓冲液、反应条件和启动策略的单独反应容器中进行。两步RT-PCR使用随机六聚体、低聚dT引物和基因特异性引物的混合物进行，提供样本中所有RNA物种的完整cDNA档案，而不是像一步法那样仅使用基因特异性引物。此外，反转录和PCR的解偶联允许对每个反应进行单独优化，以获得大效率和序列。这允许在反转录过程中获得更高的cDNA产量，并为cDNA样本的储存提供了机会，以供将来的扩增反应或下游应用。

虽然两步RT-PCR具有高灵敏度，但与一步RT-PCR相比，它更耗时，更不适合于高速、高通量的应用。它需要额外的开管步骤、更多的移液管和样品处理，这会增加可变性和污染风险。

图2 两步RT-PCR步骤

两步法RT-PCR的优缺点及应用

两步法RT-PCR
RT引物	寡头(dT) 引物随机六聚体引物基因特异性引物三者的混合物
优点	RT引物的选择大产率的柔性反应优化对同一cDNA样本进行多重PCR反应的能力为PCR分别选择RT酶和DNA聚合酶具有更大的灵活性储存cDNA以备将来使用的能力适用于起始材料有限应用的理想方法
缺点	需要更多的设置、动手操作和机器时间额外的开管步骤和移液增加了实验误差和污染的机会使用更多试剂需要更多的优化而不是一步到位
应用	从单个RNA源扩增多个目标如果你打算储存cDNA以备进一步扩增或将来重复使用

RT-PCR扩增产物的检测

在RT-PCR中，有两种主要的方法可以检测扩增子的产生。第一种方法在所有PCR循环完成后分析扩增子扩增，称为终点RT-PCR。第二种方法在PCR循环过程中实时测量扩增子浓度，称为实时RT-PCR或定量RT-PCR（RT-qPCR）。在RT-qPCR中，几种不同类型的化学试剂可用于实时检测扩增子的产生，包括Helixyte 绿色、分子信标和TaqMan探针。

终点RT-PCR

终点 RT-PCR 分析基于 PCR 反应的平台期，用于在 PCR 反应的所有循环完成后分析扩增产物。在此方法中，扩增子通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用 DNA 结合染料（如溴化乙锭 (EtBr)）进行检测，以确定 500 至 30,000 bp 范围内的 DNA 分子大小。虽然 EtBr 是常用的 DNA 染料，但它具有致突变性和吸入毒性。相反，请考虑使用更、更环保、的替代品，例如 Gelite X100（货号 17706）、Helixyte Green（货号 17590）、Helixyte Gold（货号 17595）、Gelite Green（货号 17589）或 Gelite Orange（货号 17594）。

终点RT-PCR的优缺点及应用

终点RT-PCR
优点	方便-适用于任何双链DNA序列的分析经济-比使用定制探头更便宜
缺点	精度差，灵敏度低短动态范围<2logs 低分辨率，仅尺寸的识别不适合自动化结果不以数字表示后PCR处理
应用	基因表达分析克隆构建cDNA文库 RNA测序微阵列探针的研制物种鉴定

表2.琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳用核酸染色剂

产品名称	Ex (nm)	滤波片	规格	货号
Cyber Green 核酸凝胶染料 10000X DMSO	254 mn	Long path green filter	1 mL	17590
Cyber Green 核酸凝胶染料 [相当于 SYBR® Green] 10,000X DMSO 溶液	254 mn	Long path green filter	100 µL	17604
Cyber Orange 核酸凝胶染料 10000X DMSO	254 mn	Long path green filter	1 mL	17595
Gelite 绿色核酸凝胶染色试剂盒	254 nm or 300 nm	Long path green filter	1 Kit	17589
Gelite 橙色核酸凝胶染色试剂盒	254 nm or 300 nm	Long path green filter	1 Kit	17594
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	100 µL	17700
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	500 µL	17701
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	1 mL	17702
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	10 mL	17703
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	100 µL	17704
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	500 µL	17705
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	1 mL	17706
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液*	254 nm, 300 nm or 520 nm	Ethidium Bromide, Gel Star, Gel Green, Gel Red and SYBR filters	10 mL	17707

定量RT-PCR

在定量RT-PCR（RT-qPCR）中，荧光DNA插入染料或序列特异性荧光探针被整合到RT-PCR反应中，从而允许在PCR的指数阶段实时测量扩增子浓度。通过将扩增和检测结合到单个步骤中，RT-qPCR提供了更高的精度和准确性，并产生了比终点RT-PCR大几个数量级的动态范围的定量数据。由于其较高的敏感性，RT-qPCR通常用于分析基因表达中的mRNA，检查逆转录病毒的存在，并验证通过阵列分析获得的结果。

Helixyte Green RT-qPCR检测

使用荧光DNA插层染料（如Helixyte）进行RT-qPCR Green（货号17591）为实时检测和定量PCR扩增物提供了简单、经济的方法。Helixyte 绿色与双链DNA（dsDNA）结合，激发时发光。随着扩增子浓度随每个连续扩增周期的增加而增加，Helixyte Green的荧光强度也随之增加，与每个PCR循环中存在的双链DNA数量成比例。Helixyte 绿色比高度诱变的EtBr得多，可用于检测任何双链DNA序列的扩增，具有更高的灵敏度和更少的PCR抑制。由于DNA插入染料会与任何双链DNA结合，如引物二聚体和非特异性产物，因此使用设计良好的引物以避免扩增非靶序列非常重要。为确保扩增特异性并检查引物二聚体伪影，扩增后应进行熔融曲线分析。

表3. 用于 qPCR 的双链 DNA 结合染料

产品名称	Ex (nm)	Em (nm)	规格	货号
Cyber Green 20X水溶液PCR定量	498 nm	522 nm	5x1 mL	17591
Cyber Green 10000X水溶液PCR定量	498 nm	522 nm	1 mL	17592
Helixyte Green 双链DNA定量试剂	490 nm	525 nm	1 mL	17597
Helixyte Green 双链DNA定量试剂	490 nm	525 nm	1 mL	17598
Q4ever Green核酸染料 2000X DMSO 溶液	503 nm	527 nm	50 µL	17608
Q4ever Green核酸染料 2000X DMSO 溶液	503 nm	527 nm	1 mL	17609

用于 RT-qPCR 的 TaqMan® 探针和分子信标

在RT-qPCR 中，荧光标记的目标特异性探针用于实时测量 DNA 扩增。这种方法受益于极高的特异性，并为终用户提供了在单个反应中多重检测多个目标的机会。在许多可用的基于探针的 RT-qPCR 化学中，TaqMan® 探针和分子信标是使用广泛的，两者都依赖于共振能量转移 (FRET) 来产生荧光信号。 TaqMan® 探针依赖于 Taq DNA 聚合酶的 5'-核酸酶活性。与目标靶标互补的短寡核苷酸序列在 5' 端用荧光报告染料标记，在 3' 端用非荧光猝灭染料标记。在 PCR 循环期间，引物和探针与目标退火。当 Taq DNA 聚合酶与探针上游的引物结合并延伸时，杂交的探针被水解，含有报告染料的片段被释放。现在可以检测荧光信号，产生的荧光信号量与产生的 qPCR 产物量成正比。

与 TaqMan® 探针一样，分子信标在 5' 端用荧光报告染料标记，在 3' 端用非荧光淬灭染料标记。然而，该方法不依赖于 Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性来产生信号，而是分子信标被设计为在整个扩增过程中保持完整。在没有目标的情况下，分子信标由于其自我互补的茎结构而保持在“发夹”确认中。这使荧光报告基因和淬灭染料彼此靠近，从而防止探针发荧光。当分子信标与其目标杂交时，荧光报告基团和猝灭基团分离，报告基团染料以其特征波长发光。

注：经典荧光染料、TideFluor/TideQuencher染料，可在百萤网站查询

表4. FRET 寡核苷酸的推荐 FRET 对

供体/受体	DABCYL	TQ1	TQ2	TQ3	TQ4	TQ5	TQ6	TQ7
EDANS	+++	+++	+	-	-	-	-	-
MCA	+++	+++	+	-	-	-	-	-
Tide Fluor 1	+++	+++	+	-	-	-	-	-
FAM FITC	+	+	+++	+	-	-	-	-
Cy2® Tide Fluor 2	+	+	+++	+	-	-	-	-
HEX JOE TET	-	-	+	+++	+	-	-	-
Cy3® TAMRA Tide Fluor 3	-	-	+	+++	+	-	-	-
ROX Texas Red®	-	-	-	+	+++	+	-	-
Tide Fluor 4	-	-	-	+	+++	+	-	-
Cy5® Tide Fluor 5	-	-	-	-	+	+++	+	-
Cy5.5® Tide Fluor 6	-	-	-	-	-	+	+++	+
Cy7® Tide Fluor 7	-	-	-	-	-	-	+	+++

百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest优质的产品、详尽的技术和前沿的资讯，欢迎来电咨询！

订购电话：029-68064558
邮箱：xiaodong@tjbiolite.com;info@tjbiolite.com
QQ：1485814040
微信公众号：百萤生物
新浪微博：百萤生物-
百度贴吧：百萤生物吧
丁香通：西安百萤生物科技有限公司
生物在线：西安百萤生物科技有限公司
搜好货：西安百萤生物科技有限公司
爱采购：西安百萤生物科技有限公司

RT-PCR, 逆转录聚合酶链反应, 百萤生物, AAT Bioquest

技术天地

荧光素酶（Luciferases）	2024-02-04
AAT 代理授权书2024	2024-01-03
百萤生物2023年产品价格调整通知	2022-12-26
转移酶（Transferases）	2021-10-18
激酶(Kinases)	2021-10-18