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百萤问号:荧光素酶到底该如何检测?

如果您正在做一项实验,它需要检测荧光素酶,而这是您的第一次荧光素酶检测实验,您可能会有很多问题和假设。那么,究竟如何入门该实验,您又该注意哪些方面的问题?别着急,百萤为您一一解答。


1.什么是萤光素/萤光素酶反应?它如何起作用?

在自然界中,当化学能转化为光能时,就会发生生物发光。萤火虫,真菌和海洋生物等许多生物都出于多种原因出现生物发光。当萤光素酶催化萤光素的氧化导致发光时,就会发生该过程。反应机理如下图所示:


2.萤光素酶检测的主要目的是什么?

萤光素酶是检测启动子强度和活性的好方法。例如,如果您想研究启动子区域内的转录,可以将荧光素酶基因置于启动子后面。转录该基因后,您将根据产生的荧光强度知道自己是否具有强大的启动子。检测中产生更强的荧光意味着更多的荧光素酶被转录,这意味着您具有更强的启动子。 您也可能会遇到的另一个问题是,如果要检测基因表达,何时选择荧光素酶测定法,何时选择qPCR。要记住的是:qPCR方法将测量基因的转录本。它不会告诉您转录的控制。但是,使用萤光素酶可以测量启动子的激活和转录调控。还要考虑的另一件事是,您想要研究基因调控的深度。您可能会发现,必须同时执行这两种技术才能了解项目的主要方面。


3.我需要什么进行荧光素酶检测?

领域 研究类型 试剂 仪器 孔板/管
生物光学成像 细胞、活体动物(如:小鼠) 荧光素酶检测试剂/荧光素酶检测试剂盒 酶标仪/单管发光仪 微孔板/微量离心管

 

注:

1.试剂:您可以选择一个试剂盒来进行实验,它会包含您需要的所有必要成分;您也可以选择试剂,再配制或购买其他实验中的必要成分。如果您购买的是单独的产品,那么我们建议您考虑质量,尤其是在荧光素方面。纯度的差异会产生影响。试剂盒具有相当大的便利性,例如,您不必制作缓冲液,因为试剂盒中已经提供了它。制备萤光素储液时,无需称量,因为您的萤光素已经过测量。它还在您的实验设置中提供了统一性

2.仪器:首先检查您的仪器是酶标仪还是单管发光仪,找出您的仪器是否带有进样器。并找出您的仪器在什么波长下工作以及在什么温度下工作。所有这些都将帮助您进一步规划实验。(酶标仪允许您读取孔板中的样品。通常范围在96到384之间;单管发光仪,将读取单个微量离心管。)

3.孔板/管:对于这种测定类型,必须使用平坦的底板(不要使用圆底的孔板)。它们是专门为光学检查和细胞培养应用而设计的。透明的孔板使您可以看到裂解物,但缺点是相邻的孔中的背景可能会影响您的观察。白色的孔板可以防止出现这种背景。但是,您看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解决可见性和背景问题,但价格昂贵。如何选择,取决于您的实验需求及资金。


4.萤光素酶检查的基本步骤是什么?

荧光素酶检查的步骤非常相似,无论您是进行双重报告基因分析还是单个报告基因。基本步骤如下:

  1. 选择荧光素酶报道基因(萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶等)。如果要进行双重报告基因检测,则萤光素酶需要进行不同的光谱检查。
  2. 将报告基因克隆到质粒中。如果您要进行双重报告基因检测,则将其他报告基因克隆到单独的质粒中。
  3. 将质粒与实验细胞共转染
  4. 经过24至48小时培养后,取出培养基并裂解细胞
  5. 将包含萤光素的缓冲液添加到裂解物中,使用酶标仪进行检测

这些是您可以遵循的一般步骤。实际情况应根据您要执行的分析类型和实验目标,调整实验方法。


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