细胞增殖检测（Cell Proliferation Assays）

细胞增殖分析在细胞生物学和药物发现研究中有着广泛的应用。 它们通常用于评估正常细胞的健康状况，对于评估新型化疗药物的抗增殖效力和化合物毒性至关重要。百萤提供了多种检测细胞增殖的方法，这些方法通过跟踪细胞分裂或检测细胞健康的关键参数，包括代谢活动、DNA 合成或 ATP 浓度。 从用于确定细胞增殖的各种传统比色试剂中进行选择，特别是四唑盐，以及用于流式细胞术、成像和微孔板应用的几种基于荧光的高灵敏度检测。

选择正确的细胞增殖检测

检测细胞增殖的准确方法是通过 DNA 复制过程中的 BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷）掺入来检测新合成的 DNA。 虽然高度准确和可重复，但这种方法相当繁琐，因为随后需要用荧光抗 BrdU 抗体进行检测增殖。 或者，可以通过使用 WST、刃天青或细胞酯酶裂解染料检测代谢活性速率或使用 CytoTell 染料或 CFSE试剂来更快检测细胞增殖。 终，选择适合您目的的细胞增殖检测主要取决于细胞类型、研究方案和您希望研究的作用机制。 下表概述了可用的细胞增殖检测类型。

表1. 检测细胞增殖的方法

DNA 合成 细胞增殖

原位检测新合成的 DNA 是鉴定增殖细胞的可靠和的方法。 实现这一目标的一种方法是在细胞周期的 S 期将胸苷类似物 BrdU (17030) 掺入新复制的 DNA 中。 然后可以使用荧光标记的抗 BrdU 抗体检测增殖的 BrdU 标记的细胞。 BrdU 染色适用于各种应用，包括 IHC、ICC 和 ELISA等。

应用于点击化学的 Bucculite XdU 细胞增殖检测

与 BrdU 检测不同，Bucculite XdU 细胞增殖检测不依赖于抗体来量化新生DNA，也不需要 DNA 变性来促进 BrdU 标记的核苷的抗体检测。 相反，Bucculite XdU 细胞增殖检测使用含有炔烃的胸苷类似物 XdU 的专有混合物，将其掺入新合成的 DNA 中，随后通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应进行检测（即点击反应，图 1）。

图1. Bucculite XdU 细胞增殖检测原理

由于点击反应利用双正交部分来检测增殖细胞，因此背景干扰小。 更重要的是，由于反应条件温和，Bucculite XdU 细胞增殖检测可保留细胞形态、抗原结合位点和样品完整性。 XdU 掺入后，点击反应和后续洗涤步骤可在 60 分钟内完成，新生 DNA 可使用标准成像系统或流式细胞仪进行检测。 还提供绿色、红色和深红色荧光的无铜 Bucculite FdU 细胞增殖检测试剂盒。 这些试剂盒利用我们的专利 Buccutite 标记化学技术促进在活跃增殖的细胞中检测新合成的 DNA。

图2. 使用 Bucculite XdU在流式细胞仪中检测细胞增殖

表2. 用于流式细胞术和成像的 Bucculite 细胞增殖分析

用于细胞增殖的染料示踪检测

CFSE 和 CytoTell 指示剂是荧光示踪染料，可用于通过流式细胞术检测活细胞中的细胞增殖。 随着细胞分裂，荧光染料均匀分布在子细胞之间，导致荧光强度随着每一代细胞逐渐减半。 这些增殖染料可用于在体外和体内长期跟踪细胞增殖数代。

使用 CFSE 进行增殖检测

CFSE（货号22022）和 ReadiUse CFSE (22028) 是可渗透细胞的绿色荧光增殖指示剂，当被 488 nm 氩离子激光激发时，会发出 517 nm 的荧光信号。 两种染料被动地扩散穿过未受损的细胞膜，从而与细胞内酯酶的酶反应从 CFSE 裂解乙酸基团，产生胺反应性羧基荧光素，SE 与细胞内的蛋白质共价结合。 虽然 CFSE 仍然被广泛用作在 498 nm 激发的绿色荧光增殖指示剂，但 CFSE 对细胞有剧毒，容易泄漏染料，并且已知会溢出到 PE 和 PE-Texas Red 通道中。

CytoTell 增殖指示剂

CytoTell 染料是一系列可渗透细胞的荧光示踪剂，用于检测活细胞中的细胞增殖，而没有 CFSE 的任何缺点。 在被动扩散穿过细胞膜后，CytoTell 染料被细胞内酯酶水解，产生高度荧光的胺反应性或硫醇反应性染料，不可逆地与细胞内蛋白质上的胺或硫醇基团结合。 细胞毒性极小，染料在经过几代分裂后能很好地保留在细胞内。 使用 CytoTell UltraGreen (22240) 后传代9代仍可以检测到荧光。 CytoTell 染料有 7 种不同的荧光发射颜色，为多色分析提供了更大的灵活性。

图3. 使用 CytoTell Green 和 CFSE 的细胞增殖分析

表3. 用于流式细胞术的 CytoTell 和 CFSE 细胞增殖染料

细胞增殖的代谢检测

代谢指示剂，如四唑盐和刃天青，通过检测代谢活跃细胞的细胞还原，来检测增殖。 还原后，这些底物产生明亮的比色产物，可以使用分光光度计或酶标仪以低或高通量配置进行检测。 还可以使用荧光酶标仪检测还原的刃天青。

使用四唑盐进行增殖检测

用于检测增殖的四种类型的四唑盐是 MTT、MTS、XTT 和 WST-8。 MTT 是常见的，但是，对于大多数商业 MTT 分析，在定量之前需要将紫色甲臜产物溶解在 DMSO 或异丙醇中。 方便的 Cell Meter 比色 MTT 细胞增殖试剂盒 (22768) 将细胞计数任务简化为易于混合和读取的形式，无需溶解。 在560 nm确定的甲臜浓度与活细胞数成正比。

图4. 使用 Cell Meter 比色 MTT 细胞增殖试剂盒检测细胞增殖

在其他四唑盐中，水溶性 WST-8 的灵敏度高。 细胞脱氢酶对 WST-8 的还原产生水溶性橙色甲臜晶体，在定量前不需要溶解。 甲臜产物的浓度可以通过测量 460 nm 处的吸光度来确定，并且与活细胞的数量成正比。 Cell Meter 比色 WST-8 细胞定量试剂盒提供了一种灵敏的检测方法，具有高达每孔 10⁶ 个细胞的线性。 不需要预先混合组分，因为 WST-8 底物可以方便地以溶液形式提供，可以直接添加到细胞中。

图5. 使用 Cell Meter 比色 WST-8 细胞定量试剂盒检测细胞增殖

表4. 用于检测细胞增殖的比色 MTT 和 WST-8 四唑盐测定法

使用刃天青进行增殖检测

与上述四唑盐一样，氧化还原指示剂刃天青 (15700) 可用于检测细胞增殖。 还原后，蓝色非荧光刃天青产生一种粉红色且高度荧光的试卤灵产品，该产品与荧光和吸光度酶标仪兼容。 荧光或比色信号与样品中的活细胞数量成正比。 据报道，刃天青已成功用于多种细胞类型，包括细菌、酵母、真菌、原生动物和培养的哺乳动物细胞。

表5. 刃天青相关产品

细胞增殖的 ATP 检测

ATP 存在于所有代谢活跃的细胞中，而在死细胞中几乎不存在，这是识别活细胞的标志物。 ATP 定量分析已被用于确定细菌和哺乳动物细胞中的细胞增殖和细胞毒性，并用于检测水、土壤和血液等样品中的低水平细菌污染。虽然可以使用多种检测方法，但研究人员通常选择荧光素-荧光素酶生物发光的 ATP 检测法来测量细胞增殖，因为它具有更高的灵敏度。 PhosphoWorks发光法 ATP 检测试剂盒提供了一种使用萤火虫荧光素酶及其底物荧光素检测ATP 的简单方法。在 Mg²⁺ 存在下，萤火虫萤光素酶催化萤光素、ATP 和 O₂ 的反应产生约 560 nm 的光，可使用光度计检测。存在的 ATP 浓度与样品中活细胞的数量成正比。还提供 PhosphoWorks 比色 ATP 检测试剂盒 (21617) 和 PhosphoWorks 荧光 ATP 检测试剂盒 (21620)，它们可以分别检测 100 µL 反应体积中的 ~3 µM 或 ~0.4 µM ATP。

图 6. 使用 PhosphoWorks 发光法 ATP检测试剂盒 在 96 孔白板上使用 NOVOstar 酶标仪（BMG Labtech）检测 Jurkat 细胞。 该试剂盒可检测低至 100 个细胞。

表6. 用于测量细胞增殖的 ATP 分析