|
（ELISA） 酶联免疫吸附测定是一种基于平板的免疫测定，用于检测和量化生物分子，如抗体、蛋白质、激素或肽，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸的相互作用。在 ELISA 中，通常是抗原，被固定在固体表面上，随后用与酶（如辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 偶联的抗体）进行探测。定量是通过与底物一起孵育来实现的，底物由酶催化，产生可测量的副产物。
ELISA（酶联免疫吸附测定）概述
ELISA 检测传统上在 96 孔微孔板中进行。这些板旨在被动结合和固定抗原，通常通过直接吸附到微孔板表面或间接通过预包被的“捕获”抗体。一旦固定，一抗被引入样品，与抗原形成免疫复合物。一抗可以与酶（如 HRP）共价标记，或者如果一抗用生物素标记，则可以使用酶标记的二抗或链霉亲和素偶联物间接检测自身。检测是通过与合适的底物一起孵育来评估结合酶的活性来实现的。底物的灵敏度和成像设备的兼容性各不相同，在设计 ELISA 时应仔细考虑。
ELISA的三种检测形式
1.直接ELISA
在直接 ELISA 中，抗原通过被动吸附直接固定在平板表面上，并使用 HRP 标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品中，该底物与酶缀合物反应，并产生可检测的副产物。根据底物的选择，这种副产物可以是比色的、化学发光的或荧光的。信号产生的幅度与样品中抗原的量成正比。在所有 ELISA 形式中，直接 ELISA 检测是简单、快速的，但灵敏度低。
| 直接 ELISA 特点 |
| 应用 |
- 用于评估抗体亲和力和特异性
- 用于检查阻断/抑制相互作用
|
| 优点 |
- 简单快速，需要更少的试剂和更少的步骤
- 了二抗的交叉反应
|
| 缺点 |
- 抗原固定不是特异性的，导致潜在的高背景干扰
- 一抗必须单独标记，既费时又费钱
- 一抗偶联物的免疫反应性可能受到酶的不利影响
- 灵活性低，因为必须偶联一抗
- 无信号放大
|
比色直接ELISA操作方案
- 用测试抗原包被 ELISA 板，密封板并在 4°C 下孵育过夜
- 去除涂层溶液并用所需的缓冲液洗板 2 次
- 用所需封闭液在 4°C 下封闭平板 1 小时
- 用缓冲液洗板 3 次
- 与 HRP 标记的一抗在室温下孵育 1 小时
- 用缓冲液洗板 4 次
- 用 ReadiUse TMB 底物溶液（货号 11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
- 使用 ELISA 酶标仪检测 650 nm 处的吸光度信号
2.间接ELISA
间接 ELISA 本质上是直接 ELISA 的改进版本。在间接 ELISA 中，用于检测抗原的一抗是未结合的。相反，酶标记的二抗与一抗的宿主物种发生反应，用于检测一抗 - 抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品中，该底物与酶缀合物反应，并产生可检测的副产物。根据底物的选择，这种副产物可以是比色的、化学发光的或荧光的。信号产生的幅度与样品中抗原的量成正比。使用二级检测试剂比直接 ELISA 具有信号放大的明显优势。
| 间接 ELISA 特点 |
| 应用 |
|
| 优点 |
- 可购买——多种预标记的二抗可商购
- 经济——需要更少的标记抗体
- 高度敏感—— 一抗包含多种表位，可结合多种标记的二抗使信号放大
- 非常灵活——一个二抗可用于检测不同的一抗
- 保留一抗的大免疫反应性
- 不同的可视化标记可用于相同的一抗（例如生物素/链霉亲和素）
|
| 缺点 |
- 潜在的二抗交叉反应，导致非特异性染色
- 与直接 ELISA 形式相比，方案更长，因为该方案需要额外的孵育步骤
|
比色间接ELISA操作方案
- 用测试抗原包被 ELISA 板，密封板并在 4°C 下孵育过夜
- 去除涂层溶液并用所需的缓冲液洗板 2 次
- 用所需封闭液在 4°C 下封闭平板 1 小时
- 用缓冲液洗板 2 次
- 与未偶联的一抗在室温下孵育 1 小时
- 用缓冲液洗板 4 次
- 与 HRP 标记的二抗（在封闭缓冲液中）在室温下孵育 1 小时
- 用缓冲液洗板 4 次
- 用 ReadiUse TMB 底物溶液（货号 11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
- 使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号
3.夹心ELISA
夹心 ELISA 检测是常用的 ELISA 形式。它需要使用匹配的抗体对，从而每个抗体对抗原上不同的非重叠表位具有特异性。其中一种抗体，称为捕获抗体，首先涂覆在微孔板的表面上，以促进目标抗原的固定。然后称为检测抗体的第二抗体与捕获抗体 - 抗原复合物结合（因此叫“夹心法”，因为抗原结合在匹配的抗体对之间）。后，添加对检测抗体（而非捕获抗体）具有特异性的酶标二抗偶联物。一旦二抗与检测抗体结合，酶标二抗就会催化与其各自底物的反应产生可测量的信号。
| 夹心ELISA特点 |
| 应用 |
|
| 优点 |
- 高度灵敏——比直接或间接 ELISA 法灵敏 2 到 5 倍
- 非常灵活——可以使用直接和间接检测
- 高特异性——由于使用了匹配的抗体对，抗原被特异性捕获和检测
- 适用于复杂、粗制或不纯的样品——抗原在测量前不需要纯化
|
| 缺点 |
- 匹配抗体对的优化可能很困难——捕获抗体和检测抗体可能会发生交叉反应
|
比色夹心ELISA操作方案
- 用捕获抗体、密封板覆盖 PCV 微量滴定板的孔，并在 4°C 下孵育过夜
- 去除涂层溶液并用所需的缓冲液洗板 2 次
- 用所需封闭液在 4°C 下封闭平板 1 小时
- 用所需的缓冲液洗板 2 次
- 每孔加入样品，37°C孵育2小时
- 取出样品并用所需缓冲液洗板 2 次
- 与未偶联的检测抗体在室温下孵育 1 小时
- 用所需的缓冲液洗板 4 次
- 与 HRP 标记的二抗（在封闭缓冲液中）在室温下孵育 1 小时
- 用所需的缓冲液洗板 4 次
- 用 ReadiUse TMB 底物溶液（货号 11012）在室温下孵育板 15-30 分钟。
- 使用 ELISA 酶标仪测量 650 nm 处的吸光度信号
用于 ELISA 的抗体和其他探针
单克隆抗体、多克隆抗体或两者的组合通常作为检测或捕获抗体用于 ELISA 分析。单克隆抗体本质上是单价的，对每个抗原的单个表位具有特异性。在所有 ELISA 形式中，单克隆抗体通常用作检测抗体。因为它们很少与其他蛋白质发生交叉反应，并且不太可能产生非特异性信号。相比之下，多克隆抗体是抗体的复杂混合物，可识别单个抗原中的多个表位。虽然它们经常在夹心 ELISA 测定中用作“捕获抗体”以尽可能多地拉下抗原，但它们也可以用作检测抗体。多克隆抗体对批次间的差异非常敏感，应在使用前进行彻底的检测和验证。
ELISA 二级偶联物
HRP 和 Poly-HRP 二抗
辣根过氧化物酶（（HRP，#11025）通常与二抗或链霉亲和素结合，用于间接或夹心 ELISA 检测。HRP 在 ELISA 中被广泛采用作为报告基因主要是由于三个因素。第一, HRP 有能力放大弱信号并增强低表达抗原的可检测性。其次，与其他报告酶（例如碱性磷酸酶（~140 kDa））相比，HRP 相对较小的尺寸（~44 kDa）进一步了细胞内渗透到样品中，减少空间位阻并大程度地减少免疫反应性损失。第三，HRP 的高周转率和良好的稳定性可以实现快速和强烈的信号生成。MegaWox poly-HRP 二级偶联物旨在在 ELISA 检测中提供高灵敏度和低背景。
表1. HRP 二抗
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
| 11035 |
MegaWox polyHRP-羊抗鼠IgG缀合物 |
1 mg |
| 11037 |
MegaWox polyHRP-羊抗兔IgG缀合物 |
1 mg |
| 16728 |
HRP-标记羊抗鼠免疫球蛋白(H+L) |
1 mg |
| 16793 |
HRP-标记羊抗兔免疫球蛋白(H+L) |
1 mg |
表2. 酶链霉亲和素偶联物
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
| 16920 |
链霉亲和素 HRP-标记 |
1 mg |
| 16921 |
链霉亲和素偶联物 AP-标记 |
1 mg |
ELISA 底物
比色ELISA底物
比色（或显色）底物与酶反应生成可观察到的有色副产物，可使用吸光度酶标仪进行检测。百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供比色底物，其灵敏度和光密度不等。
表3. ELISA 比色酶底物
| 酶 |
底物 |
吸收 (nm) |
颜色 |
检出限 |
规格 |
货号 |
| AP |
pNPP |
405 |
黄色 |
∼10 ng/well (100 ng/mL) |
25 mg |
11619 |
| HRP |
ABTS |
420 |
蓝绿色 |
∼250 pg/well (2.5 ng/mL) |
1 L |
11001 |
| HRP |
TMB |
650, 450 |
蓝色、黄色 |
4∼12.5 pg/well (40-120 pg/mL) |
100 mL |
11012 |
| HRP |
TMB |
650, 450 |
蓝色、黄色 |
4∼12.5 pg/well (40-120 pg/mL) |
1 L |
11003 |
荧光ELISA底物
荧光底物与酶反应产生高荧光副产物，可使用荧光酶标仪进行检测。光激发后的光子发射程度与样品中抗原的量成正比。 百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供荧光底物，其灵敏度和荧光特性各不相同。
表4. ELISA 荧光酶底物
| 酶 |
底物 |
Ex (nm) |
Em (nm) |
规格 |
货号 |
| AP |
SunRed 磷酸基团近红外荧光底物 |
652 nm |
660 nm |
5 mg |
11629 |
| AP |
PhosLite磷酸基团绿色荧光底物 |
345 nm |
520 nm |
1 mg |
11630 |
| AP |
4-甲基伞形酮磷酸酯 MUP无游离酸 |
360 nm |
448 nm |
5 g |
11617 |
| AP |
4-甲基伞形酮磷酸酯 MUP无游离酸 |
360 nm |
448 nm |
25 mg |
11614 |
| AP |
4-甲基伞形酮磷酸二钠盐三水 MUP二钠盐 |
360 nm |
448 nm |
10 g |
11612 |
| AP |
4-甲基伞形酮磷酸二钠盐三水 MUP二钠盐 |
360 nm |
448 nm |
25 mg |
11610 |
| AP |
FDP(荧光素二磷酸酯四铵盐) |
497 nm |
516 nm |
5 mg |
11600 |
| AP |
荧光碱性磷酸酶底物 DiFMUP |
360 nm |
450 nm |
5 mg |
11627 |
| HRP |
Amplite 红色HRP荧光底物 |
570 nm |
583 nm |
1000 Assays |
11011 |
| HRP |
Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物 |
646 nm |
667 nm |
1 mg |
11009 |
| HRP |
Amplite™ Blue |
324 nm |
409 nm |
25 mg |
11005 |
| HRP |
Amplite™ ADHP |
570 nm |
583 nm |
25 mg |
11000 |
化学发光ELISA底物
化学发光底物与酶反应生成可使用光度计检测的发光副产物。由于光子的发射是化学反应而非光激发的结果，因此背景干扰小。 百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供化学发光底物，其灵敏度和化学发光特性各不相同。
表5. ELISA 发光酶底物
| 酶 |
底物 |
Em (nm) |
规格 |
货号 |
| AP |
D-荧光素磷酸盐 CAS 145613-12-3 |
|
1 mg |
12512 |
| HRP |
鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酸酐) |
410 nm |
1 mg |
11050 |
百萤生物是美国AAT Bioquest中国区域代理商，为您提供AAT Bioquest优质的产品、详尽的技术和前沿的资讯，欢迎来电咨询！
|
