NADP、NADPH相关问题解答（AAT）

 

1.为什么我的总NAD / NADH读数与我的各个NAD / NADH读数的总数不匹配？ 

答：导致这种情况的可能原因是NADH提取物读数不准确。根据初始NAD浓度，NADH提取液可能无法从样品孔中所有NAD，这意味着某些NAD将保留并混淆读数。考虑到检测探针是高度敏感的，即使很小的残留NAD也会影响荧光测量。这就是为什么我们建议用户测量总NAD / NADH和NAD提取物的原因。然后从那里可以将NADH浓度计算为总NAD / NADH减去NAD提取物。通常，这将对浓度以及NAD / NADH比值进行更准确的测量。

 

2.Amplite 荧光NAD / NADH比率测定试剂盒*红色荧光*是否可以与NADP / NADPH一起使用？该试剂盒可以测量NADP +和NADPH吗？

答：此试剂盒无法测量NADP / NADPH。但是，我们确实提供了另一种试剂盒，可以定量NADP / NADPH比率。参见Amplite™荧光NADP / NADPH比率检测试剂盒*红色荧光*

    

3.Amplite 荧光NAD / NADH比率测定试剂盒*红色荧光*是否可用于植物细胞？细菌细胞？哺乳动物细胞？用于组织样本？

答：是的，该试剂盒可用于植物，细菌，哺乳动物和组织细胞样品。每种细胞类型的制备指南如下：

植物细胞样品：

用200 mg / mL的裂解缓冲液匀浆叶子，并以2500 rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。

细菌细胞样品：

离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15分钟）。使用约100至1000万个细胞/ mL裂解液，将处理过的溶液在室温下放置15分钟，以2500 rpm离心5分钟后，用上清进行测试。

 

哺乳动物细胞样品：

从板孔中除去培养基，每1-5百万个细胞使用约100 µL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中为50-100 µL /孔），并将处理过的溶液在室温下放置15分钟。直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，将上清液用于测试。

 

组织样品：

称量约20 mg组织，用冷PBS洗涤。在微量离心管中用400 µL裂解缓冲液匀浆。以2500 rpm离心5-10分钟，将上清液用于测定。

 

4.Amplite 荧光NAD / NADH比率测定试剂盒*红色荧光* pH敏感吗？我是否必须在特定的pH缓冲液中准备样品？pH值会影响我的荧光读数吗？

答：pH是NAD或NADH萃取步骤中的一个因素。NADH提取步骤（和相应的缓冲液，组分D）是碱性的（pH> 7），而NAD提取步骤（和相应的缓冲液，组分E）是酸性的（pH <7）。此外，与大多数荧光探针一样，我们的NADH传感器对pH敏感。读数应在中性条件下（pH≈7）进行。

 

5.典型的NAD与NADH比率是多少？

答：在哺乳动物细胞中，总NAD / NADH比率通常被引用为10：1，而游离细胞质NAD / NADH比率估计约为725：1。

 

6.NADH和ROS是否相关？

答：活性氧（ROS）是涉及氧化还原反应的多种细胞途径的潜在破坏性生化副产物，其中主要的是辅酶NAD +和NADP促进的能量途径。这些辅酶的还原形式用于ROS的解毒，各种ROS本身以临时方式用于细胞内和细胞间信号传导。目前在细胞中约有 400个已知的涉及NAD + / NADH的氧化还原反应，另外约30个涉及磷酸化的NADP / NADPH的氧化还原反应。这些分子的深远影响使得它们的测量和可视化即使在看似无关的实验中也很有用。

 

7.如何为Amplite 荧光NAD / NADH比分析试剂盒*红色荧光*制备/裂解细胞样品？

答：提供了裂解缓冲液（组分G）。您可以使用《细胞样品制备方案》中概述的样品制备指南。

 

8.我能在不裂解细胞的情况下测量NADPH吗？

答：大多数传统的印迹和蛋白质检测方法都涉及细胞裂解物，但近年来，已开发出新的探针，可以可视化活细胞中NADP + / NADPH的水平。细胞内探针将使研究人员无需进行细胞裂解步骤即可进行测量。对于多参数实验，请选择处于极端波长的荧光团，以减少光谱重叠和数据校正的必要性。

9.在NADP / NADPH（或NAD / NADH）分析中分析细胞裂解物之前，我们是否需要对样品进行脱蛋白处理？

答：细胞裂解液无需脱蛋白即可直接使用。以下是有关如何制备用于NAD / NADH和NADP / NADPH分析的HL60细胞裂解液的方案：

（1）1 mL HL 60细胞（1〜2X10 ^ 6细胞/ mL）

（2）离心去除培养基

（3）向细胞沉淀中加入200μL裂解缓冲液

（4）在37°C下孵育15分钟

（5）离心5分钟以去除细胞沉淀

（6）上清液可直接用作样品

 10.哪些检测试剂盒可测量细胞样品中的NAD / NADH？

答：我们提供比色和荧光分析试剂盒，用于测量细胞样品中的NAD，NADH，NAD / NADH比以及总NAD和NADH，请参见下表。