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聚合酶链反应（PCR）

PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中广泛使用的一种核心技术，用于在体外快速扩增特定的DNA模板。它使研究人员能够产生大量样本DNA，用于广泛的下游实验室和临床应用，包括克隆、基因分型、测序、诱变和病原体检测，以诊断传染病。自1985年引入以来，已经开发了PCR过程的多次迭代，包括用于实时监测DNA扩增的定量PCR（qPCR）和用于检测RNA的逆转录PCR（RT-PCR），这是一种用于病毒诊断的工具。

为了准确和灵敏的PCR检测，百萤为序列特异性分子信标的开发提供了PCR参考染料、脱氧核苷酸三磷酸盐、双链DNA结合染料、荧光报告染料和非荧光淬灭及的组合产品。

 

PCR原理

PCR通常用于在体外将单个DNA模板扩增成数百万或数十亿个相同的拷贝。典型的扩增反应需要DNA模板、耐热DNA聚合酶、正向和反向引物、脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）和反应缓冲液（表1）。这些成分组合在PCR或Eppendorf管中，然后放置在热循环器中以促进扩增过程。在热循环器内，PCR混合物经历一系列温度和时间调整，其中包括三个关键步骤：（1）模板变性，（2）引物退火，（3）引物延伸。


PCR过程

在变性过程中，双链DNA模板在95°C下加热两分钟。高温导致DNA模板中互补碱基对之间的氢键分离为两个单链组分。接下来，将温度降低至50-65°C约20-40秒，以便于对每个单链DNA进行引物退火。退火后，温度升高至70-74°C以开始延伸。在此步骤中，DNA聚合酶将结合并延伸引物以形成新生的DNA链。它通过沿着DNA模板碱基在5'到3'方向上移动，并从反应混合物中添加相应的互补dNTP来实现。总之，这三个步骤被称为PCR循环，每个循环后，双链DNA片段的数量加倍。PCR循环重复25至30次，以指数方式扩增原始DNA模板。

视频1 .演示聚合酶链反应三个关键步骤的动画视频教程：（1）模板变性，（2）引物退火，和（3）引物延伸。

表1 PCR所需成分的汇总

PCR组分 作用
DNA模板 这是包含要扩增的目标序列的样本DNA
耐热DNA聚合酶 催化形成与目标序列互补的新DNA链的酶。常用的聚合酶包括TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。
引物（正向和反向） 与样本DNA杂交并开始复制过程的短的单链DNA序列。引物设计用于补充DNA模板开始和结束处的序列，用于扩增。
脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs） 这些是合成DNA片段的“构建块”，通常以ReadiUse形式提供™ dNTP混合料*10 mM*（货号17200）
含镁反应缓冲液 这为PCR反应提供了一个稳定的环境。其适宜pH值为8.0至9.5，并用氯化镁强化，氯化镁是DNA聚合酶的辅助因子。

 

PCR产物的常规分析 

PCR过程完成后，用溴化乙锭（EtBr）对反应产物进行染色，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以确定DNA分子的大小和浓度。虽然溴化乙锭是最常用的DNA染料，但它具有诱变性和剧毒。因此，考虑使用无毒的替代物，例如HelixTe green（货号17590），Helixyte gold（货号17595），Gelite green（货号17589）或Gelite orange（货号17594）。

表2.琼脂糖凝胶电泳用无毒DNA染色剂

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X水溶液* 513 nm 552 nm 1 mL 17702
Gelite Safe核酸凝胶染料* 10,000X DMSO溶液* 513 nm 552 nm 1 mL 17706
Gelite 绿色核酸凝胶染色试剂盒 254 or 300 nm¹ Long path green filter 1 Kit 17589
Gelite 橙色核酸凝胶染色试剂盒 254 or 300 nm¹ Long path green filter 1 Kit 17594
Cyber Green 核酸凝胶染料 10000X DMSO 497 nm 521 nm 1 mL 17590
Cyber Green 核酸凝胶染料 [相当于 SYBR® Green] *10,000X DMSO 溶液* 497 nm 521 nm 100 µL 17604
Cyber Orange 核酸凝胶染料 10000X DMSO 496 nm 539 nm 1 mL 17595

 

 

PCR的类型

传统的PCR方法，如上述过程，只能扩增DNA，需要琼脂糖凝胶电泳从反应终点确定PCR成功。这一过程非常耗时，并受到各种阻碍，包括灵敏度低、分辨率低、精度差、非自动化、PCR后处理和动态范围短。为了解决这些问题，已经开发了PCR过程的多次迭代，包括用于实时监测DNA扩增的定量PCR（qPCR）和用于检测RNA的逆转录PCR（RT-PCR）。

逆转录聚合酶链反应

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种检测和定量mRNA表达水平的高度灵敏技术。在RT-PCR中，使用逆转录酶将RNA模板反转录成互补DNA（cDNA）。然后使用标准PCR程序（变性、退火和延伸）将cDNA用作指数扩增的模板。RT-PCR被用于各种应用，包括基因表达分析、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。

定量聚合酶链反应

定量或实时PCR（qPCR）使研究人员能够实时检测DNA模板的扩增，而不是像常规PCR那样在其终点进行检测。它使用荧光报告分子进行检测，荧光报告分子结合并检测PCR过程中每个周期产生的产物。随着反应的进行，由于PCR产物在每个扩增周期中的累积，荧光增加。这些荧光报告分子包括与双链DNA（dsDNA）结合的染料，如Helixyte Green（货号17591）和Q4ever Green（货号17608）或荧光标记的序列特异性探针，如TaqMan®探针、分子信标和Scorpion®探针。

 

qPCR染料

在qPCR中，双链DNA结合染料常用作荧光报告物来检测基因表达。报告染料的荧光随着产物在每次连续放大循环中的累积而增加。记录每个周期的荧光发射量可以在指数阶段监控PCR反应。与微阵列相比，qPCR在检测表达水平的适度变化方面更为敏感，因此非常适合研究小的基因亚群。尽管双链DNA结合染料为qPCR提供了最方便、最便宜的选择，但PCR产物积累检测的主要缺点是特异性产物和非特异性产物都会产生信号。

图1 使用Helixyte的qPCR 绿色（货号17591）。在延伸阶段，DNA聚合酶通过加入与DNA模板互补的dNTPs来延伸序列特异性引物。当新合成的双链DNA产生时， Helixyte Green将与DNA复合物结合并发出荧光。

表3.用于qPCR的双链DNA结合染料

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Cyber Green 20X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 5x1 mL 17591
Cyber Green 10000X水溶液PCR定量 498 nm 522 nm 1 mL 17592
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17597
Helixyte Green 双链DNA定量试剂 490 nm 525 nm 1 mL 17598
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 50 µL 17608
Q4ever Green核酸染料 *2000X DMSO 溶液* 503 nm 527 nm 1 mL 17609

qPCR探针

基于探针的qPCR利用靶向特异性探针精确检测PCR反应每个周期的DNA扩增。虽然探针设计可能不同，但它们通常共享三个关键元素：与目标序列互补的短寡核苷酸、标记在5'端的荧光报告染料和3'端的淬灭染料（有关推荐的FRET对的信息，见下表）。由于被称为共振能量转移（FRET）现象，报告染料的荧光被淬灭染料掩盖，而探针保持完整。当DNA聚合酶在延伸过程中延伸引物时，它还水解已退火至单链DNA模板的序列特异性探针，将报告染料与淬灭剂分离，并导致荧光的扩增依赖性增加。基于探针的qPCR是一种有利于特异性杂交、无假阳性和在单个反应管中对多个靶序列进行多重分析的有利方法。

图2.基于探针的qPCR的图示

 

表4 荧光报告染料，用于在序列特异性qPCR探针上标记5'端或3'端

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Tide Fluor 1 CPG 500Å EDANS的卓越代替品 341 448 100 mg 2240
Tide Fluor 1 CPG 1000Å EDANS的卓越代替品 341 448 100 mg 2241
6-FAM亚磷酰胺单体 5’-荧光素氨基磷酸酯 493 517 100 µmoles 6016
6-FAM亚磷酰胺单体 5’-荧光素氨基磷酸酯 493 517 10x100 µmoles 6017
6-荧光素亚磷酰胺单体 498 517 100 µmoles 6018
6-荧光素亚磷酰胺单体 498 517 10x100 µmoles 6019
3’-(6-荧光素) CPG*1000 Å* 498 517 1 g 6014
6-TET亚磷酰胺单体 5’-四氯荧光素氨基磷酸酯 521 543 50 µmoles 6021
6-TET亚磷酰胺单体 5’-四氯荧光素氨基磷酸酯 521 543 100 µmoles 6027
6-TET亚磷酰胺单体 5’-四氯荧光素氨基磷酸酯 521 543 10x100 µmoles 6025
VIC亚磷酰胺 526 543 50 µmoles 6080
VIC亚磷酰胺 526 543 100 µmoles 6081
VIC亚磷酰胺 526 543 1 g 6082
6-HEX亚磷酰胺单体 5’-六氯荧光素氨基磷酸酯 533 559 100 µmoles 6026
6-HEX亚磷酰胺单体 5’-六氯荧光素氨基磷酸酯 533 559 10x100 µmoles 6024
Tide Fluor 3亚磷酰胺[TF3 CEP] Cy3亚磷酰胺的优异替代品 546 571 100 µmoles 2274
6-TAMRA 6-羧基四甲基罗丹明 CPG*1000 Å* 552 578 1 g 6051

表5 用于在序列特异性qPCR探针上标记5'端或3'端的非荧光淬灭染料

产品名称 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
3'-DABCYL CPG *1000Å* 454 N/A 1 g 6008
5’-DABCYL C6 氨基磷酸酯 454 N/A 1 g 6009
荧光淬灭剂Tide Quencher 1亚磷酰胺 492 N/A 100 µmoles 2198
荧光淬灭剂Tide Quencher 1 CPG *500Å* 492 N/A 100 mg 2193
荧光淬灭剂Tide Quencher 1 CPG *1000Å* 492 N/A 100 mg 2194
Tide Quencher™ 2 phosphoramidite [TQ2 phosphoramidite] 516 N/A 100 µmoles 2208
荧光淬灭剂Tide Quencher 2亚磷酰胺 516 N/A 100 mg 2203
荧光淬灭剂Tide Quencher 2 CPG *1000Å* 516 N/A 100 mg 2204
BXQ-1 CPG (500 A) 522 N/A 100 mg 2408
BXQ-1 CPG (1000 A) 522 N/A 100 mg 2410
BXQ-2 CPG (500 A) 554 N/A 100 mg 2428
BXQ-2 CPG (1000 A) 554 N/A 100 mg 2430
荧光淬灭剂Tide Quencher 3亚磷酰胺 573 N/A 100 µmoles 2228
荧光淬灭剂Tide Quencher 3 CPG *500Å* 573 N/A 100 mg 2223
荧光淬灭剂Tide Quencher 3 CPG *1000Å* 573 N/A 100 mg 2224
荧光淬灭剂 Tide Quencher 4 CPG 603 N/A 100 mg 2062
荧光淬灭剂Tide Quencher 4 CPG *1000Å* 603 N/A 100 mg 2063
荧光淬灭剂Tide Quencher 5 CPG *500Å* 661 N/A 100 mg 2077
荧光淬灭剂Tide Quencher 5 CPG *1000Å* 661 N/A 100 mg 2078

表6 用于开发FRET寡核苷酸的推荐FRET对

供体/受体 DABCYL TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5 TQ6 TQ7
EDANS +++ +++ + - - - - -
MCA +++ +++ + - - - - -
Tide Fluor 1 +++ +++ + - - - - -
FAM
FITC		 + + +++ + - - - -
Cy2®
Tide Fluor 2		 + + +++ + - - - -
HEX
JOE
TET		 - - + +++ + - - -
Cy3®
TAMRA
Tide Fluor 3		 - - + +++ + - - -
ROX
Texas Red®		 - - - + +++ + - -
Tide Fluor 4 - - - + +++ + - -
Cy5®
Tide Fluor 5		 - - - - + +++ + -
Cy5.5®
Tide Fluor 6		 - - - - - + +++ +
Cy7®
Tide Fluor 7		 - - - - - - + +++

表7 用于多重qPCR分析的ROX参照和报告染料

仪器 参照染料 报告基因染料1 报告基因染料2 报告基因染料3 报告基因染料4
ABI PRISM® 7700 ROX 6-FAM 6-TET - -
ABI PRISM® 7000 and 7900
Applied Biosystems® 7300
StepOnePlus 		ROX 6-FAM 6-TET 6-HEX -
Applied Biosystems® 7500 ROX 6-FAM 6-TET 6-HEX Tide Fluor 3
iFluor 647
Alexa Fluor 647
Cy5

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