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二抗Secondary Antibodies

二抗偶联物是生物化学和细胞研究中的重要工具。酶标二抗,如 HRP 二抗,具有高催化转化率,并因其快速和稳定的信号生成而常用于各种检测。 HRP 二抗已广泛用于酶联免疫吸附测定 (ELISA)、侧向流动测定 (LFA)、免疫组织化学 (IHC) 和用于传染病诊断的蛋白质印迹。与荧光染料偶联的二抗可在细胞分析和蛋白质分析应用(包括免疫荧光显微镜和细胞成像)中提供更亮的信号和多路复用功能。

酶标和染料标记的二抗最重要的特点是灵敏度高和信号放大。

二抗的使用

二抗是间接检测的关键组成部分。二抗与一抗按顺序使用,通过与一抗结合,从而促进目标抗原的检测、定量和纯化,一抗直接与抗原结合。虽然使用二抗需要额外的免疫标记步骤,但与直接检测方法相比,它具有许多优势,即信号放大和灵活性。信号放大源于二抗对一抗上指定区域(例如 Fc 区)的特异性。这允许多个二抗与单个一抗结合,从而放大信号并提高灵敏度(图 1)。由于可用报告分子的多样性,二抗的使用还为用户提供了灵活性。例如,iFluor 800 染料标记和 iFluor 680 染料标记的二抗可在蛋白质检测应用(如蛋白质印迹)中实现双色成像。

 

图1. 使用目标特异性抗体进行直接和间接抗原检测。

 

二抗的选择

选择正确的抗体将通过增加信号检测同时最大限度地减少非特异性结合和背景干扰来提高检测的灵敏度。选择二抗时,请考虑以下关键因素:

匹配一抗的宿主物种

二抗应针对所用一抗的宿主和目标物种产生。例如,如果使用在人类中产生的一抗单克隆抗体,则必须使用在非人类物种中产生的抗人二抗,例如山羊抗人 IgG。 AAT Bioquest 常见的宿主特异性二抗包括:

 

为您的应用选择正确的报告分子

二抗通常与可检测的标记物(如酶、荧光团或生物素)结合。标记的选择取决于将使用和检测二抗的下游应用。

表1. 二抗偶联物的常见应用

应用 推荐的二抗类型
酶联免疫吸附测定(ELISA)
  • 酶(HRP 或 AP)偶联二抗最常用于间接、夹心和竞争性 ELISA
侧向流动测定(LFA)
  • 荧光标记的二抗(例如 iFluor 染料或 Alexa Fluor®)
  • 酶(HRP 或 AP)偶联二抗
蛋白免疫印迹(Western blot)
  • 酶(HRP 或 AP)偶联的二抗是最常用的
  • 荧光标记的二抗(例如 iFluor 染料或 Alexa Fluor®)也用于多路复用和红外免疫印迹
免疫荧光
免疫组化
  • 酶(HRP 或 AP)偶联二抗
  • HRP 介导的 Styramide 信号放大
免疫细胞化学
  • 酶(HRP 或 AP)偶联二抗
  • HRP 介导的 Styramide 信号放大
  • 荧光标记的二抗(例如 iFluor 染料或 Alexa Fluor®)

 

用于 ELISA 的抗体和其他探针

单克隆抗体、多克隆抗体或两者的组合通常作为检测或捕获抗体用于 ELISA 分析。单克隆抗体本质上是单价的,对每个抗原的单个表位具有特异性。在所有 ELISA 形式中,单克隆抗体通常用作检测抗体。因为它们很少与其他蛋白质发生交叉反应,并且不太可能产生非特异性信号。相比之下,多克隆抗体是抗体的复杂混合物,可识别单个抗原中的多个表位。虽然它们经常在夹心 ELISA 测定中用作“捕获抗体”以尽可能多地拉下抗原,但它们也可以用作检测抗体。多克隆抗体对批次间的差异非常敏感,应在使用前进行彻底的检测和验证。

ELISA 二级偶联物

HRP 和 Poly-HRP 二抗

辣根过氧化物酶((HRP,#11025)通常与二抗或链霉亲和素结合,用于间接或夹心 ELISA 检测。HRP 在 ELISA 中被广泛采用作为报告基因主要是由于三个因素。第一, HRP 有能力放大弱信号并增强低表达抗原的可检测性。其次,与其他报告酶(例如碱性磷酸酶(~140 kDa))相比,HRP 相对较小的尺寸(~44 kDa)进一步改善了细胞内渗透到样品中,减少空间位阻并最大程度地减少免疫反应性损失。第三,HRP 的高周转率和良好的稳定性可以实现快速和强烈的信号生成。MegaWox poly-HRP 二级偶联物旨在在 ELISA 检测中提供高灵敏度和低背景。

表2. HRP 二抗

货号 产品名称 规格
11035 MegaWox polyHRP-羊抗鼠IgG缀合物 1 mg
11037 MegaWox polyHRP-羊抗兔IgG缀合物 1 mg
16728 HRP-标记羊抗鼠免疫球蛋白(H+L) 1 mg
16793 HRP-标记羊抗兔免疫球蛋白(H+L) 1 mg

表3. 酶链霉亲和素偶联物

货号 产品名称 规格
16920 链霉亲和素 HRP-标记 1 mg
16921 链霉亲和素偶联物 AP-标记 1 mg

 

ELISA 底物

比色ELISA底物

比色(或显色)底物与酶反应生成可观察到的有色副产物,可使用吸光度酶标仪进行检测。百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供比色底物,其灵敏度和光密度不等。

表4. ELISA 比色酶底物

底物 吸收 (nm) 颜色 检出限 规格 货号
AP pNPP 405 黄色 ∼10 ng/well (100 ng/mL) 25 mg 11619
HRP ABTS 420 蓝绿色 ∼250 pg/well (2.5 ng/mL) 1 L 11001
HRP TMB 650, 450 蓝色、黄色 4∼12.5 pg/well (40-120 pg/mL) 100 mL 11012
HRP TMB 650, 450 蓝色、黄色 4∼12.5 pg/well (40-120 pg/mL) 1 L 11003

 

荧光ELISA底物

荧光底物与酶反应产生高荧光副产物,可使用荧光酶标仪进行检测。光激发后的光子发射程度与样品中抗原的量成正比。 百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供荧光底物,其灵敏度和荧光特性各不相同。

表5. ELISA 荧光酶底物

底物 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
AP SunRed 磷酸基团近红外荧光底物 652 nm 660 nm 5 mg 11629
AP PhosLite磷酸基团绿色荧光底物 345 nm 520 nm 1 mg 11630
AP 4-甲基伞形酮磷酸酯 MUP无游离酸 360 nm 448 nm 5 g 11617
AP 4-甲基伞形酮磷酸酯 MUP无游离酸 360 nm 448 nm 25 mg 11614
AP 4-甲基伞形酮磷酸二钠盐三水 MUP二钠盐 360 nm 448 nm 10 g 11612
AP 4-甲基伞形酮磷酸二钠盐三水 MUP二钠盐 360 nm 448 nm 25 mg 11610
AP FDP(荧光素二磷酸酯四铵盐) 497 nm 516 nm 5 mg 11600
AP 荧光碱性磷酸酶底物 DiFMUP 360 nm 450 nm 5 mg 11627
HRP Amplite 红色HRP荧光底物 570 nm 583 nm 1000 Assays 11011
HRP Amplite 过氧化物和过氧化酶近红外荧光底物 646 nm 667 nm 1 mg 11009

 

化学发光ELISA底物

化学发光底物与酶反应生成可使用光度计检测的发光副产物。由于光子的发射是化学反应而非光激发的结果,因此背景干扰最小。 百萤为辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 提供化学发光底物,其灵敏度和化学发光特性各不相同。

表6. ELISA 发光酶底物

底物 Em (nm) 规格 货号
AP D-荧光素磷酸盐 CAS 145613-12-3   1 mg 12512
HRP 鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酸酐) 410 nm 1 mg 11050

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