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荧光染料AM酯

我们实验中常用的荧光染料AM酯是易于渗透完整活细胞的疏水化合物,被广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。非极性AM酯容易穿过活细胞膜,并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。酯化基团的水解对于分析多种细胞功能至关重要。在某些情况下(例如,钙黄绿素AM),AM酯在水解之前是无色且无荧光的。

图1.Fluo-3 AM的原理加载到活细胞中进行细胞内Ca 2+检测。


AM酯类储存条件

存放在–20℃,避光。有效期为自收到之日起6个月。

AM酯溶解、储存方案

  1. 准备1至10 mM的AM酯储备溶液,加入到无水二甲基亚砜(DMSO)。DMSO储备溶液应密封保存,在-20°C下保持干燥,并避光。在这些条件下,AM酯应稳定数月。注意:AM酯容易水解,特别是在溶液中。因此,应使AM酯储备溶液尽可能地浓缩以获得最佳结果。DMSO的最低水含量(理想情况下≤0.1%)。
  2. 非离子型洗涤剂的Pluronic ® F-127可用来增加AM酯的水溶解度。注:20%的Pluronic等体积® F-127溶液可以在加载缓冲液之前加入到DMSO储备溶液中。最终的Pluronic ® F-127的浓度为约0.02%。各种Pluronic® F-127可以从百萤生物购买。不推荐在AM酯溶液中加入Pluronic® F-127后长期储存。

使用AM酯加载细胞

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该方案仅提供指南,实际应根据您的特定需求进行修改。

  1. 在实验当天,将制备好的AM酯储存溶液解冻至室温。在您选择的缓冲液(例如Hanks和Hepes缓冲液)中,准备1至10 µM(可能需要更高浓度的弱荧光指示剂)的工作溶液。对于大多数细胞系,建议使用AM酯的含量为(4-5 µM)。实验中必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影,建议尝试使用较少的染料浓度来达到相对大的信号强度。
  2. 如果含有有机阴离子转运的细胞,可以将丙磺舒(1-2.5 mM)或亚砜吡嗪(0.1- 0.25 mM)添加到细胞培养基中,以减少去酯化指示剂的泄漏。在室温或37°C下将细胞与AM酯孵育20分钟至一小时(弱荧光指示剂需要更长的孵育时间)。
  3. 在无染料的缓冲液中洗涤细胞,以去除多余的探针。(含有有机阴离子转运的细胞洗涤时,需要适用型且包含阴离子转运蛋白抑制剂的缓冲液)。
  4. 在所需的Ex / Em波长下测量荧光强度。

AM酯产品

下表总结了本公司出售的AM酯产品

表1.   紫外线激发钙指示剂

Ca2+ 指示剂 货号 Excitation Emission MW
Calcein blue, AM 21007 360 nm 445 nm 465.41
CytoCalcein Violet 450 22012 408 nm 460 nm ~400
Fura-2, AM 21020, 21021, 21022, 21023 340/380 nm 510 nm 1001.86
Indo-1, AM 21030, 21032, 21033, 21036 355 nm 400/475 nm 1009.91
Quin-2, AM 21050 346 nm 475 nm 829.76

表2.   可见光激发钙指示剂

Ca2+ 指示剂 货号 Excitation Emission MW
Calcein, AM 22002, 22003, 22004 490 nm 515 nm 994.86
Fluo-3, AM 21010, 21011, 21012, 21013, 21014 506 nm 526 nm 1129.85
Quest Fluo™-8™, AM 21080, 21081, 21082, 21083 490 nm 514 nm ~1000
Quest Fluo™-8H™, AM 21090, 21091 490 nm 514 nm ~1100
Quest Fluo-8L™, AM 21096, 21097 490 nm 514 nm ~1100
Quest Rhod-4™, AM 21120, 21121, 21122, 21123 530 nm 555 nm ~1000
Rhod-2, AM 21060, 21062, 21063, 21064 549 nm 578 nm 1123.96
Rhod-5N, AM 21070 551 nm 577 nm 1154.92

表3.   非荧光激发钙指示剂

Ca2+ 指示剂 货号 MW
BAPTA, AM 21001, 21002 764.68
EGTA AM 21005, 21006 668.6

表4.   其他离子荧光指示剂

AM 酯 货号 Excitation Emission MW
BCECF, AM 21202, 21203, 21204 505 nm 520 nm 808.69