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细胞凋亡篇:细胞中的增殖凋亡探索

 

细胞凋亡是可能发生在多细胞生物中的程序性细胞死亡过程。凋亡生化事件导致特征性细胞形态变化和死亡。这些变化包括起泡、细胞收缩、核碎裂、染色质凝聚和染色体 DNA 碎裂。与坏死不同,细胞凋亡产生凋亡小体碎片,吞噬细胞能够吞噬这些碎片当细胞内容物溢出到周围细胞并在造成损害之前迅速将其清除。细胞增殖和凋亡的平衡对于发育和正常组织稳态都很重要。细胞增殖是由于生长和分裂而导致细胞数量增加。细胞增殖受细胞周期调节,细胞周期分为一系列阶段。

自 1990 年以来,关于细胞凋亡及其相关的研究大幅增加。除了作为一种生物学现象的重要性之外,有缺陷的细胞凋亡过程还与多种疾病有关。细胞凋亡过多会导致萎缩,而数量不足会导致细胞增殖失控,例如癌症。 百萤生物提供全面的试剂组合,用于研究各种样品中的细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡。


 一、细胞周期

细胞周期有四个连续的阶段:G0/G1、S、G2 和 M。在细胞通过细胞周期的过程中,它的 DNA 在 S(合成)阶段被复制,并在 M((有丝分裂)的两个子细胞之间平均分布) 阶段。这两个阶段由两个间隙阶段分隔:G0/G1 和 G2。这两个间隙阶段为细胞生长提供了时间,并使它们的蛋白质和细胞器的质量倍增。细胞通过细胞周期的过程由许多不同的调节蛋白控制。

我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞活力和增殖的工具。在正常细胞中,DNA 密度的变化取决于细胞是在生长、分裂、静止还是进行正常细胞活动。细胞周期的进程受各种细胞周期调节因子之间复杂的相互作用的控制。这些调节因子激活转录因子,转录因子与 DNA 结合后会开启或关闭导致细胞分裂的蛋白质的产生。这种调节过程中的任何失误都会导致异常细胞增殖,这是许多病理状况(例如肿瘤形成)的基础。活细胞研究的潜在应用是确定细胞 DNA 含量和细胞周期分布,以检测生长模式的变化、检测细胞凋亡以及评估肿瘤细胞行为和抑制基因机制。

 

图1.生长的 Jurkat 细胞中的 DNA 图谱。使用#22845进行检测。

图2.使用 Cell Meter 荧光细胞周期检测试剂盒(货号#22841)对Jurkat 细胞进行检测。

 

表1:Cell Meter 荧光法细胞周期检测试剂盒

品牌 名称 货号 规格 Ex/Em(nm)
AAT Bioquest Cell Meter 荧光法细胞周期检测试剂盒 绿色荧光 适合于流式细胞检测  #22841 100 Tests 503/527
AAT Bioquest Cell Meter 荧光法细胞周期检测试剂盒 红色荧光 适合于流式细胞检测  #22842 100 Tests 652/682
AAT Bioquest Cell Meter 荧光法细胞周期检测试剂盒 405nm激发  #22845 100 Tests /
AAT Bioquest Cell Meter 荧光法活细胞周期检测试剂盒 红色荧光 适用于流式细胞仪  #22860 100 Tests /

 

 二、细胞增殖

1.CytoTell染料

CFSE 是首选的细胞增殖指示剂,广泛用于活细胞分析。然而,使用 CFSE 检测细胞增殖的过程中存在一些严重的问题。 1. CFSE 对细胞有剧毒,因为 CFSE 会不加选择地与所有氨基发生反应,从而影响许多关键的细胞内蛋白质功能(如细胞膜 GPCR); 2.CFSE响应慢,使用不方便。第二代细胞的CFSE荧光强度比第一代降低了10倍以上。 3.需要去除介质。由于 CFSE 会与培养基成分发生反应,因此您必须使用流式细胞仪去除培养基进行细胞分析。

我们研发的CytoTell染料,可以改善上述 CFSE 的缺点。 CytoTell Green 也可用于长期跟踪标记细胞。用 CytoTell Green 标记的细胞可以固定和透化,以使用标准的含甲醛固定剂和透化缓冲液分析细胞内靶标。 CytoTell Green 可以被 488 nm 激发光线激发,峰值发射在 520 nm,这使其与 FITC 滤光片组兼容。

图 3.CytoTell染料工作原理。 CytoTell染料由三个成分组成:a荧光阻断剂; b掩蔽荧光团;c细胞保留部分。进入活细胞后,CytoTell 染料的荧光通过去除荧光阻断剂释放,释放的荧光团通过细胞保留基团保留在细胞中

 

表2:CytoTell染料

产品名称 货号 规格 Ex/Em(nm)
CytoTell 绿色 22240 500 Tests 492/514
CytoTell 蓝色 22251 500 Tests 410/445
CytoTell 红色650 22255 500 Tests 626/643
CytoTell 橙色 22257 500 Tests 541/560
CytoTell紫色 500 22248 500 Tests 415/499

 

2.Brdu细胞增殖检测试剂

在细胞周期的 S 期(DNA 合成),BrdU 被整合到新合成的 DNA 中,并且可以很容易地被抗 BrdU 特异性抗体检测到。除了 DNA 增加外,某些蛋白质的水平也会由于细胞增殖而增加。例如,Ki67 是一种在分裂细胞核中表达的抗原。然而,在细胞周期的 G0 阶段,它没有被检测到。 Ki67 可与其他增殖标记物(如 BrdU 和 CytoTell 染料)结合使用。

图 4.细胞增殖表现出 DNA 合成和细胞倍增之间的密切关联。

 

表3:Brdu细胞增殖检测试剂

产品名称 货号 规格 分子量
BrdU 细胞增殖检测试剂 17030 25 mg 307.09
BrdUTP 17031 100 ul 612.98
BrUTP 17032 100 ul 628.98

 

3.刃天青细胞增殖检测试剂

刃天青是一种无毒、水溶性和氧化还原敏感性染料,在通过许多生物过程还原为试卤灵后,它会从蓝色/无荧光状态变为粉红色/高荧光状态。添加到活细胞中的刃天青通过细胞中的酶促或化学反应通过尚不为人知的机制减少。此功能广泛用于测量细胞增殖、活力和细胞毒性。可在培养期间的任何时间加入刃天青。对于细胞增殖的测量,最好在对数生长期期间添加刃天青。孵育时间可能因被测细胞系的代谢率而异。可以使用 544 nm/590 nm 滤光片组读取荧光。可以使用设置为 570 nm 的分光光度计读取吸光度。

 

4.CCK-8细胞凋亡检测试剂盒

cck-8是一种基于 WST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),WST-8 是一种类似于 MTT 的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜(formazan)。WST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅;颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

图 5.CCK-8 检测细胞活性原理图

 

表4:cck-8及其相关产品

产品名称 货号 规格
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) TJ35000-TJ35004 1ml/5ml/10ml/30ml/100ml
WST-8检测试剂 15705-15707 25mg/100mg/1g
比色法WST-8检测试剂盒 22770/22771 1000Tests/5000Tests
比色法MTT检测试剂盒 22768/22769 1000Tests/5000Tests

 

5.Bucculite系列细胞增殖检测试剂盒

检测细胞增殖的一种基本方法是在细胞生长的S期过程中,在存在胸腺嘧啶核苷的情况下检测DNA合成。我们的Bucculite系列产品使用FdU、XdU等,该产品是BrdU和EdU的完美替代品。

图 6.分别使用FdU和XdU检测S期HeLa细胞图像。

 

表5:Bucculite系列产品

产品名称 货号 规格
Bucculite FdU 细胞增殖荧光成像试剂盒 22305 / 22315 / 22320 200 Tests
Bucculite XdU细胞增殖荧光成像试剂盒 22321 / 22323 / 22325 / 22326 / 22327 / 22328 100 Tests/200 Tests

 

三、细胞凋亡

表6:不同凋亡探针的特点

凋亡引起的细胞变化 可使用的探针 特点及仪器应用
细胞膜改变(PS外露) Annexin V检测试剂/试剂盒

检测早期凋亡标志物,流式细胞术或免疫荧光应用

Caspase激活(细胞质) Caspase 活性检测试剂/试剂盒 快速、简单和高通量
Caspase 结合(细胞质) 荧光半胱天冬酶抑制剂/试剂盒 ELISA、流式细胞术、Western Blot
DNA 片段化(核) BrdU检测、TUNEL检测 贴壁细胞、流式细胞术周期分析
线粒体变化 线粒体染色 使用流式细胞术、荧光显微镜或荧光酶标仪进行快速、简单的单细胞分离

 

1.Caspase家族

细胞凋亡早期阶段的一个显著特征是半胱天冬酶的激活。 半胱氨酸——天冬氨酸特异性蛋白酶 caspase (CED-3/ICE) 家族的成员,已被确定为与细胞凋亡相关的复杂生化事件的关键介质。 caspase 的识别位点由三到四个氨基酸标记。 半胱天冬酶蛋白酶通常作为无活性前体合成。

图 7.半胱天冬酶敏感的肽片段掩蔽氨基染料然后被半胱天冬酶消化以产生高度荧光染料。 荧光强度增加与半胱天冬酶活性成正比。

 

表7:人半胱天冬酶功能分类

细胞死亡途径 Caspase类型 caspase酶 所属生物
细胞凋亡 起始因子 Caspase 2 人或鼠
细胞凋亡 起始因子 Caspase 8 人或鼠
细胞凋亡 起始因子 Caspase 9 人或鼠
细胞凋亡 起始因子 Caspase 10
细胞凋亡 效应因子 Caspase 3 人或鼠
细胞凋亡 效应因子 Caspase 6 人或鼠
细胞凋亡 效应因子 Caspase 6 人或鼠
细胞焦亡 炎症 Caspase 1 人或鼠
细胞焦亡 炎症 Caspase 4
细胞焦亡 炎症 Caspase 5
细胞焦亡 炎症 Caspase 11
细胞焦亡 炎症 Caspase 12 部分人或鼠
细胞焦亡 炎症 Caspase 13

 

表8:半胱天冬酶活性的肽识别序列 对于半胱天冬酶底物和抑制剂

肽识别序列 氨基酸序列 目标Caspase
IETD Ile-Glu-Thr-Asp Caspase 8, Granzyme B
DEVD Asp-Glu-Val-Asp Caspase 3, 6, 7, 8, or 10
LEHD Leu-Glu-His-Asp Caspase 9
VAD Val-Ala-Asp Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9 or 10

 

表9:显色半胱天冬酶底物

底物 目标Caspase 吸收 (nm) 颜色 规格 货号
Ac-DEVD-pNA *CAS 189950-66-1* Caspase 3 405 nm 黄色 5 mg 13405
Z-DEVD-pNA Caspase 3 405 nm 黄色 5 mg 13422
Z-IETD-pNA *CAS 219138-21-3* Caspase 8, Granzyme B 405 nm 黄色 5 mg 13413

 

表10:荧光半胱天冬酶底物

底物 目标Caspase Ex (nm) Em (nm) ε¹ Φ² 规格 货号
Ac-DEVD-AFC *CAS 201608-14-2* Caspase 3, 7 376 482 17000 0.53 5 mg 13401
Ac-DEVD-AMC *CAS 169332-61-0* Caspase 3, 7 341 441 19000 N/D 5 mg 13402
Z-DEVD-AFC Caspase 3, 7 376 482 17000 0.53 5 mg 13420
Z-DEVD-AMC *CAS 1135416-11-3* Caspase 3, 7 341 441 19000 N/D 5 mg 13421
Z-DEVD-ProRed™ 620 Caspase 3, 7 532 619 N/D N/D 1 mg 13433
(Z-DEVD)2-R110 *CAS 223538-61-2* Caspase 3, 7 500 522 80000 N/D 1 mg 13430
Z-DEVD-ProRed™ 620 Caspase 3, 7 532 619 N/D N/D 1 mg 13433
Ac-IETD-AFC *CAS 211990-57-7* Caspase 8, Granzyme B 376 482 17000 0.53 5 mg 13410
Ac-IETD-AMC Caspase 8, Granzyme B 341 441 19000 N/D 5 mg 13411
Z-IETD-AFC *CAS 219138-02-0* Caspase 8, Granzyme B 376 482 17000 0.53 5 mg 13425
(Ac-IETD)2-R110 Caspase 8, Granzyme B 500 522 80000 N/D 1 mg 13431
Z-IETD-ProRed™ 620 Caspase 8, Granzyme B 532 619 N/D N/D 1 mg 13434
Ac-LEHD-AMC *CAS 292633-16-0* Caspase 9 341 441 19000 N/D 5 mg 13426
(Ac-LEHD)2-R110 Caspase 9 500 522 80000 N/D 1 mg 13427
Z-LEHD_ProRed™ 620 Caspase 9 532 619 N/D N/D 1 mg 13435

 

表11:可逆和不可逆半胱天冬酶抑制剂

抑制剂 目标Caspase 结合 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Ac-DEVD-CHO *CAS 169332-60-9* Caspase 3, 7 可逆的 - - 1 mg 13403
Ac-IETD-CHO *CAS 191338-86-0* Caspase 8 可逆的 - - 5 mg 13412
mFluor 450-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 406 445 25 tests 13475
mFluor™ 510-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 412 505 25 tests 13476
FITC-C6-DEVD-FMK Caspase 3, 7 不可逆 491 516 1 mg 13406
FITC-C6-DEVD-FMK Caspase 3, 7 不可逆 491 516 100 µg 13408
FITC-C6-LEHD-FMK Caspase 9 不可逆 491 516 1 mg 13407
FITC-C6-LEHD-FMK Caspase 9 不可逆 491 516 100 µg 13409
FAM-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 493 517 25 tests 13470
SRB-VAD-FMK [Sulforhodamine B-VAD-FMK] Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 559 577 25 tests 13472
TF4-VAD-FMK Caspase 1, 2, 3, 6, 8, 9, 10 不可逆 578 602 25 tests 13471

 

1.1 Caspase 3、7、8 和 9 活性检测

Cell Meter Caspase 活性检测试剂盒为检测细胞中的 Caspase 活性提供了一种强大而方便的方法。这些试剂使用含有识别位点的底物,这些识别位点专用于检测 caspase 3 和 7、caspase 8 或 caspase 9 的激活,以及设计用于同时检测所有四种 caspase 的多重检测。半胱天冬酶识别序列的结合抑制了荧光团或发光团产生可量化信号的能力。在适当激活的半胱天冬酶存在的情况下,荧光团或发光团从识别序列上切割下来并自由产生表示细胞凋亡的荧光或发光信号。 

图 8.Jurkat 细胞中 Caspase 活性的检测。 Jurkat 细胞在同一天以 200,000 个细胞/孔接种在 Costar 黑色/透明 96 孔板中。 细胞用终浓度为 1 mM 的星形孢菌素处理 4 小时(红色条),而未处理的细胞用作对照(蓝色条)。 添加单 caspase 检测溶液(100 µL/孔)(caspase 3/7 #1、caspase 8 #2 或 caspase 9 #3)或三重 caspase 检测溶液(caspase #4 加入 3/7、8 和 9)并在室温下孵育 1 小时。 使用 FlexStation 荧光酶标仪在指定波长检测荧光强度。 caspase 3/7、8 和 9 的活性可以在单次测定中检测到,而不受其他 caspase 的干扰。

 

表12:用于检测 Caspase 3、7、8 和 9 活性的试剂盒

试剂盒 平台 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Cell Meter Caspase 3/7活性细胞凋亡检测试剂盒 蓝色荧光 微孔板/HCS 360 570 200 tests 22795
Cell Meter Caspase 3/7活性细胞凋亡检测试剂盒 绿色荧光 微孔板/HCS 490 525 200 tests 22796
Cell Meter Caspase 3/7活性细胞凋亡检测试剂盒 红色荧光 微孔板/HCS 540 620 200 tests 22797
Cell Meter Caspase 3/7活性细胞凋亡检测试剂盒 绿色荧光 适合于流式细胞检测 流式细胞仪 488 530 100 tests 22823
Cell Meter Caspase 8活性细胞凋亡检测试剂盒 蓝色荧光 微孔板/HCS 370 450 200 tests 22812
Cell Meter Caspase 8活性细胞凋亡检测试剂盒 红色荧光 微孔板/HCS 490 525 200 tests 22798
Cell Meter Caspase 8活性细胞凋亡检测试剂盒 红色荧光 微孔板/HCS 540 620 100 tests 22816
Cell Meter Caspase 9活性细胞凋亡检测试剂盒 蓝色荧光 微孔板/HCS 375 435 200 tests 22813
Cell Meter Caspase 3/7/8/9活性细胞凋亡复用检测试剂盒 三色荧光 微孔板/HCS 三重荧光 三重荧光 100 tests 22820

 

表13:caspase 3/7 活性溶液的检测

产品名称 样品类型 平台 Ex (nm) Em (nm) 规格 货号
Amplite 比色法Caspase 3/7活性检测试剂盒 黄色荧光 Cell Extracts 光吸收酶标仪 490 / 200 tests 13507
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 蓝色荧光 Cell Extracts 荧光酶标仪 350 450 500 tests 13502
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 绿色荧光 Cell Extracts 荧光酶标仪 490 525 500 tests 13503
Amplite 荧光法Caspase 3/7活性检测试剂盒 红色荧光 Cell Extracts 荧光酶标仪 535 620 100 tests 13504

 

1.2 活细胞 Caspase 结合分析

在细胞凋亡中,关键事件之一是半胱天冬酶的激活,这对于细胞凋亡的启动很重要。 Cell Meter 活细胞 Caspase 结合试剂盒使用荧光细胞渗透性和无毒探针来检测 Caspase 1、2、3/7、6、8、9、10 和 13 的活性。一旦与半胱天冬酶结合,荧光试剂就会保留在细胞内。结合后会阻止半胱天冬酶进一步催化,但不会阻止细胞凋亡的进行。 Caspase 结合试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪和荧光酶标仪。

 

表14:caspase 结合检测试剂盒

产品名称 目标Caspase Ex (nm) Em (nm) 滤波片 通道 规格 货号
Cell Meter 活细胞Caspase 1结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 1 490 525 FITC FL1 25 Tests 20108
Cell Meter 活细胞Caspase 2结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 2 490 525 FITC FL1 25 Tests 20111
Cell Meter 活细胞Caspase 3/7结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 3/7 490 525 FITC FL1 25 Tests 20100
Cell Meter 活细胞Caspase 3/7结合检测试剂盒 红色荧光 Caspase 3/7 550 595 TRITC FL1 25 Tests 20101
Cell Meter 活细胞Caspase 6结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 6 490 525 FITC FL1 25 Tests 20113
Cell Meter 活细胞Caspase 8结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 8 490 525 FITC FL1 25 Tests 20115
Cell Meter 活细胞Caspase 9结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 9 490 525 FITC FL1 25 Tests 20117
Cell Meter 活细胞Caspase 10结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 10 490 525 FITC FL1 25 Tests 20119
Cell Meter 活细胞Caspase 13结合检测试剂盒 绿色荧光 Caspase 13 490 525 FITC FL1 25 Tests 20125
Cell Meter 通用Caspase活性荧光法检测试剂盒 红色荧光 适合于流式细胞检测 Caspase-1, 3/7, 4, 5, 6, 8, 9 649 664 - APC 25 Tests 22822

 

2. Annexin V

细胞膜的改变是活细胞早期凋亡的标志。在细胞凋亡的初始阶段,磷脂酰丝氨酸 (PS) 残基从细胞膜的内叶转移到外叶。在细胞成像和流式细胞术中,荧光标记的膜联蛋白 V 缀合物通常用于与外化 PS 残基结合来检测凋亡细胞。

 

表15:膜联蛋白 V 缀合物简介

应用 检测外化磷脂酰丝氨酸以识别凋亡细胞
适用仪器 荧光显微镜、其他活细胞成像仪器和流式细胞仪
活细胞 适用
可固定 可以,用甲醛染色后固定
多路复用 可用于多重分析

 

2.1 用于检测细胞凋亡的膜联蛋白 V 缀合物

与 iFluor 染料结合的膜联蛋白 V 提供了一种快速可靠的方法来检测外化 PS。 Annexin V iFluor 探针的卓越亮度和光稳定性明显优于大多数 Alexa Fluor® 和其他光谱相似的 Annexin v 缀合物。

 

表16:可用于细胞凋亡检测的膜联蛋白 V 缀合物

Annexin V 标签 Ex (nm) Em (nm) 滤波片 ε Φ 规格 货号
iFluor 350 345 450 DAPI 20000 0.95 100 tests (200 µL) 20070
iFluor 488 491 516 FITC 75000 0.9 100 tests (200 µL) 20071
iFluor 555 557 570 TRITC 100000 0.64 100 tests (200 µL) 20072
iFluor 594 588 604 Texas Red 180000 0.53 100 tests (200 µL) 20073
iFluor 633 640 654 Texas Red 250000 0.29 100 tests (200 µL) 20069
iFluor 647 656 670 Cy5 250000 0.25 100 tests (200 µL) 20074
iFluor 680 684 701 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20075
iFluor 700 690 713 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20077
iFluor 750 757 779 Cy7 275000 0.12 100 tests (200 µL) 20076
AF350 (Alexa Fluor® 350 equivalent) 343 441 DAPI 19000 N/D³ 100 tests (200 µL) 20090
AF488 (Alexa Fluor® 488 equivalent) 499 520 FITC 73000 0.92 100 tests (200 µL) 20092
AF594 (Alexa Fluor® 594 equivalent) 590 618 Texas Red 92000 0.66 100 tests (200 µL) 20096
FITC 491 516 FITC 73000 0.79 100 tests (200 µL) 20030
TRITC 544 570 TRITC 100000 0.1 100 tests (200 µL) 20031
Cy3 555 569 Cy3/TRITC 150000 0.04 100 tests (200 µL) 20065
Cy5 656 670 Cy5 250000 0.25 100 tests (200 µL) 20066
Cy5.5 684 701 Cy5.5 220000 0.23 100 tests (200 µL) 20067
Cy7 756 779 Cy7 250000 0.3 100 tests (200 µL) 20068

 

2.2 用于流式细胞术的膜联蛋白 V 缀合物

与 mFluor 染料、PacBlue、APC 和 PE 结合的膜联蛋白 V 是通过流式细胞术检测细胞凋亡的优秀探针。这些缀合物可以与其他染料(如核酸染料)结合使用,以准确评估凋亡、坏死和死细胞的混合群体。

图 9. 在 Jurkat 细胞中检测 Annexin V-mFluor Violet 450 缀合物与磷脂酰丝氨酸的结合活性。

 

表16:可用于细胞凋亡检测的膜联蛋白 V 缀合物

Annexin V 标签 激光 Ex (nm) Em (nm) 通道 ε Φ 规格 货号
PacBlue Violet Laser 410 455 DAPI/FL-1 Channel 46000 0.78 100 tests (200 µL) 20089
mFluor Violet 450 Violet Laser 403 454 DAPI/FL-1 Channel 25000 0.92 100 tests (200 µL) 20080
mFluor Violet 510 Violet Laser 414 510 FITC/FL-1 Channel 30000 0.86 100 tests (200 µL) 20081
mFluor Violet 540 Violet Laser 424 560 PE/FL-2 Channel 15000 0.64 100 tests (200 µL) 20082
mFluor Blue 570 Blue Laser 533 570 PE/FL-2 Channel 120000 0.08 100 tests (200 µL) 20085

 

2.3 Cell Meter Annexin V系列凋亡检测

Cell Meter Annexin V 凋亡检测试剂盒提供了一种快速方便的方法,通过检测磷脂酰丝氨酸的外化来检测凋亡细胞。每个试剂盒都包含与 iFluor 染料、mFluor 染料、APC、PE 或 FITC 结合的重组膜联蛋白 V,用于检测早期凋亡细胞中易位的 PS。PI 和Nuclear Red DCS1 都不能渗透活细胞,但会用强烈的红色荧光染色坏死和死细胞。用膜联蛋白 V 缀合物和核酸染料染色细胞后,凋亡细胞会显示出膜联蛋白 V 缀合物荧光,死细胞显示出红色和膜联蛋白 V 缀合物荧光,活细胞显示出很少荧光或没有荧光。使用流式细胞仪可以很容易地区分细胞群。

 

表17:Cell Meter Annexin V 结合凋亡检测选择指南

Annexin V缀合物 死细胞染色 Annexin V 缀合物 Ex/Em 死细胞染色 Ex/Em 规格 货号
Annexin V-iFluor 488 PI 490/ 520 nm 534/617 nm 100 Tests 22824
Annexin V-iFluor 555 554/578 nm / 100 Tests 22825
Annexin V-iFluor 594 590/610 nm / 100 Tests 22826
Annexin V-iFluor 647 650/668 nm / 100 Tests 22827
Annexin V-mFluor Violet 450 PI 405/450 nm 534/617 nm 100 Tests 22828
Annexin V-mFluor™ Violet 500 PI 414/508 nm 534/617 nm 100 Tests 22829
Annexin V-mFluor Violet 550 PI 424/560 nm 534/617 nm 100 Tests 22830
Annexin V-APC PI 651/662 nm 534/617 nm 100 Tests 22837
Annexin V-PE Nuclear Red DCS1 565/575 nm 631/651 nm 100 Tests 22838
Annexin V-FITC PI 490/520 nm 534/617 nm 100 Tests 22839

 

3. TUNEL检测

在细胞凋亡的后期阶段,半胱天冬酶激活的核酸内切酶将基因组 DNA 切割成寡核小体片段(约 180-200 个碱基对长)。使用 TUNEL 检测,这些断裂的暴露 3'-OH 末端可以用修饰的 dUTP 进行标记,以便随后对原位凋亡细胞进行可视化和量化。这通常是直接使用染料修饰的 dUTP 或间接使用BrdUTP和针对 BrdUTP 的抗体缀合物来完成的。无论使用怎样的标记方式,都需要酶末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 来催化修饰的 dUTP 掺入 3'-OH 末端。

图 10. TUNEL工作原理

 

3.1 活细胞TUNEL检测

传统上,TUNEL检测需要样品的固定和透化,以促进外源性 TdT 的进入并确保成功标记 DNA 。我们的Cell Meter 活细胞 TUNEL 细胞凋亡检测是鉴定 DNA 片段化,无需酶 TdT 及其使用时的额外处理。这些检测利用专有的透膜荧光染料被动进入活细胞并选择性靶向细胞凋亡过程中形成的 DNA 切口。然后可以通过荧光显微镜、流式细胞术或基于荧光的微孔板检测直接观察荧光标记的 DNA 片段。 

Control
对照
SS 100 nM
SS 100 nM
SS 1 µM
SS 1 µM

图 11. 与未处理的对照相比,用 100 nM 或 1 µM 星形孢菌素 (SS) 处理 4 小时后 HeLa 细胞中 TUNEL 反应的荧光图像。

 

表18:用于活细胞的TUNEL 检测试剂盒

试剂盒 Ex/Em (nm) Cutoff (nm) 滤波片 通道 规格 货号
Cell Meter TUNEL凋亡检测试剂盒 绿色荧光 490/525 515 FITC Filter Set FITC Channel 25 tests 22849
Cell Meter TUNEL凋亡检测试剂盒 红色荧光 550/590-650 570 TRITC Filter Set PE-Cy5 Channel 25 tests 22844

 

3.2 用于固定细胞和组织样品的 TUNEL 检测

Cell Meter 固定细胞和组织 TUNEL 检测遵循传统的 TUNEL 方法,并针对固定细胞和组织切片中的原位凋亡检测进行了优化。这些检测通过使用 TdT 催化染料修饰的 dUTP 并掺入片段化 DNA 的 3'-OH 末端中,直接识别群体内的凋亡细胞。然后可以分别使用荧光显微镜或流式细胞术对荧光标记的 DNA 片段进行可视化或定量。 

Control
No DNase
SS 100 nM
DNase

图 12. 使用 Cell Meter 固定细胞和组织 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒*绿色荧光*对福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 人肺腺癌切片进行 TUNEL 检测。

 

表19:用于固定细胞和组织的 Cell Meter TUNEL 检测试剂盒

试剂盒 dUTP Ex/Em (nm) 通道 滤波片 规格 货号
Cell Meter 固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒*蓝色荧光* DEAC-dUTP 405/525 Pacific Orange Channel Violet Filter Set 25 tests 22857
Cell Meter 固定化细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒*绿色荧光* Fluorescein-12-dUTP 488/530 FITC Channel FITC Filter Set 25 tests 22851
Cell Meter 固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡检测试剂盒*红色荧光* TMR-dUTP 488/575 PE Channel Cy3/TRITC Filter Set 25 tests 22853
Cell Meter 固定细胞和组织TUNEL细胞凋亡测定试剂盒*深红色荧光* TF5-dUTP 633 or 640/660 APC Channel Cy5 Filter Set 25 tests 22855

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